Bepaling van de V617F-mutatie van het JAK2-gen bij chronische myeloproliferatieve syndromen in ons land: een gevalsbeschrijving
De bepaling van de V617F-mutatie van het JAK2-gen bij chronische myeloproliferatieve syndromen in ons land: een gevalsbeschrijving
Drs. Daniela Lens*, Pablo Muxi†, Lics. Andreína Brugnini‡,
Natalia Trías‡, Dra. Silvia Pierri§
Ziekenhuis de Clínicas. Faculteit der Geneeskunde.
Universiteit van de Republiek. Montevideo, Uruguay
Abstract
Polycythemia vera (PV), essentiële trombocythemie (ET) en idiopathische myelofibrose (IM) zijn nauw verwante klonale myeloproliferatieve aandoeningen die worden gekenmerkt door overmatige proliferatie van een of meer myeloïde lijngroepen zoals erytrocyten, trombocyten en fibroblasten in het beenmerg.
Weliswaar bestaan er strikte criteria voor de diagnose van deze myeloproliferatieve syndromen, maar de precieze categorisering blijft een punt van discussie en bovendien zijn deze aandoeningen in veel gevallen moeilijk te onderscheiden van reactieve processen.
Nu, in 2005, werd bij verscheidene van deze entiteiten een mutatie in het tyrosinekinasegen Janus kinase 2 (JAK2) geïdentificeerd. Deze mutatie betreft de vervanging van een G door een T op positie 1849, wat resulteert in de vervanging van een fenylalanine door een valine in het eiwit (JAK2 V617F).
De incidentie van deze mutatie werd waargenomen in ongeveer 90% van de gevallen met PV en in ongeveer 50% van de gevallen met IM en ET.
In dit artikel beschrijven wij de detectie van deze mutatie bij een patiënt met een diagnose van waarschijnlijke PV met behulp van een zeer gevoelige allelspecifieke polymerase kettingreactie (PCR) assay voor de detectie van deze mutatie en bespreken wij het belang van deze recent ontdekte mutatie bij de diagnose en behandeling van BCR-ABL-negatieve myeloproliferatieve syndromen.
Key words: MYELOPROLIFERATIEVE DISORDERS – diagnose.
MUTATIE – genetica.
PROTEIN-TYROSINE KINASE.
* Universitair hoofddocent. Basis Afdeling Geneeskunde.
† Universitair hoofddocent. Hematologie kliniek. Klinisch Departement Geneeskunde.
‡ Biochemie Lic. Assistent. Basis Afdeling Geneeskunde.
§ Universitair hoofddocent. Hematologie kliniek. Klinisch Departement Geneeskunde.
Correspondentie: Dr. Daniela Lens.
Departement. Basis Geneeskunde. Hospital de Clínicas. Piso 15. Avda Italia s/n. Montevideo CP 11600. Montevideo, Uruguay.
E-mail: [email protected]
Ontvangen: 31/7/06.
Accepted: 26/2/07.
Inleiding
In tegenstelling tot chronische myeloïde leukemie, waar de identificatie van de specifieke BCR-ABL-herschikking tot een doorbraak leidde in de diagnose, bewaking en behandeling van deze entiteit, in BCR-ABL-negatieve chronische myeloproliferatieve syndromen (PMS), zoals polycythemia vera (PV), essentiële trombocythemie (ET) en idiopathische myelofibrose (IM), waren tot zeer onlangs geen specifieke genetische veranderingen bekend.
Tussen mei en juni 2005 hebben vijf groepen onderzoekers een nieuwe puntmutatie in het JAK2-gen voor tyrosinekinase beschreven, die het gevolg is van de vervanging van een guanine door een thymine op nucleotide 1849 in exon 14, resulterend in de vervanging van een valine door een fenylalanine op positie 617 van het eiwit, waarvoor de JAK2-mutatie V617F(1-5) wordt genoemd.
Deze mutatie werd waargenomen in ongeveer 90% van de gevallen met PV wanneer zeer gevoelige assays worden gebruikt om deze op te sporen(6). Zij werd ook aangetroffen in ongeveer 50% van de gevallen met IM en ET, terwijl zij niet werd aangetroffen bij gezonde personen of bij patiënten met secundaire erytrocytose, zodat deze mutatie een zeer hoge voorspellende waarde heeft bij het onderscheiden van SMPC van niet-klonale aandoeningen zoals secundaire polycythemie.
Deze mutatie treedt op in een sterk geconserveerd deel van een auto-inhibitoir domein dat de JAK2-signalering negatief reguleert. Verschillende studies hebben aangetoond dat deze mutatie betrokken is bij de pathogenese van deze aandoeningen, met name door een toename van de functie van het JAK2-gen en door een verlies van controle die in verband worden gebracht met de excessieve myeloproliferatie van deze aandoeningen.
In dit artikel beschrijven wij de ontdekking van deze mutatie bij een patiënt met een diagnose van waarschijnlijke PV en bespreken wij het belang van deze nieuwe mutatie bij de diagnose en behandeling van BCR-ABL-negatieve SMPs.
Materiaal en methode
Extractie van desoxyribonucleïnezuur
Extractie van gendomisch desoxyribonucleïnezuur (DNA) werd uitgevoerd uit 1 ml gecitreerd perifeer bloed, met behulp van het commerciële reagens dnazol (Life Techno-logies) en volgens het door de fabrikant aangegeven protocol. De DNA-monsters werden bewaard bij 4°C.
Opsporing van de Vl617F-mutatie
De V617F-mutatie werd opgespoord uit eerder verkregen genomisch DNA door allelspecifieke polymerasekettingreactie (PCR) volgens de methode gepubliceerd door Baxter et al(1). Deze PCR is ontworpen om drie verschillende primers te gebruiken, JAK2R, JAK2F/IC en JAK2F genaamd (tabel 1). De JAK2F-primer is specifiek voor het gemuteerde allel en de JAK2F/IC-primer wordt bij alle individuen gevonden, ongeacht de aan- of afwezigheid van de mutatie, en vormt dus een interne controle van de reactie. Zo wordt bij alle individuen een product van 364 basenparen (bp) geamplificeerd met de JAK2F/IC- en JAK2R-primers, en wordt alleen bij individuen met de mutatie in kwestie een product van 203 bp verkregen met de JAK2F- en JAK2R-primers (figuur 1).
De amplificatie werd uitgevoerd in een eindvolume van 20 uL met gebruikmaking van 500 ng DNA, 200 mM/L van elk van de dNTP’s, 0,5 U Taq-polymerase (New England Biolabs) en 2 uL 10x Taq-buffer met 2 mM MgCl (New England Biolabs), 0,5 mM JAK2 F- en JAK2 F/IC-primers en 1 mM JAK2 R-primer.
Het gebruikte PCR-programma bestaat uit 36 cycli, te beginnen met een denaturatie van 5 minuten, vervolgens cycli: 30 seconden bij 94°C, 30 seconden bij 58°C en 30 seconden bij 72°C, eindigend met een laatste extensie van 5 minuten. Een negatieve controle, die alle voor de amplificatie benodigde reagentia bevat en waarbij het DNA-sjabloon is vervangen door water, werd steeds in alle reacties opgenomen. De controle van het verwachte PCR-product werd uitgevoerd op een 2% agarose gel gekleurd met ethidiumbromide(7).
Case-analyse
Mannelijke patiënt, 72 jaar, zware roker, met chronische arteriële hypertensie onder behandeling en drager van een chronische obstructieve arteriopathie die in 2002 een amputatie van de vijfde teen van de linkervoet vaststelde. In december 2004, toen hij een nieuwe obstructieve episode in de linker onderste ledemaat vertoonde, toonde zijn hemogram een toename van het aantal rode bloedcellen met een hematocriet van 66%, samen met granulocytose van 24.000 en bloedplaatjes van 245.000. Het hematocriet bleef gelijk en het aantal bloedplaatjes steeg geleidelijk tot 710.000. In het beenmergbiopsie-onderzoek werd een hypercellulair beenmerg waargenomen met hyperplasie van de erythroïde reeks, hetgeen leidde tot de conclusie van een chronisch myeloproliferatief syndroom van het PV type.
De patiënte werd behandeld met flebotomieën en startte in mei 2005 een behandeling met hydroxyurea, die in februari 2006 werd gestaakt vanwege een hemorragische complicatie.
Zoals geïllustreerd in figuur 2, vertoonde de patiënte een patroon met twee banden in het allelspecifieke PCR-onderzoek voor de V617F-mutatie van het JAK2-gen. Enerzijds is er de controleband van 364 bp, die ook aanwezig is in de twee onderzochte gezonde controles. Anderzijds werd ook een 203 bp-product geamplificeerd in de patiënt waaruit de aanwezigheid van de mutatie bleek. Deze band werd niet waargenomen bij de gezonde controles.
Discussie en conclusies
In dit werk hebben we het eerste geval beschreven waarin de V617-mutatie van het JAK2-gen in ons land is geïdentificeerd. Dit werk maakt deel uit van een multidisciplinair project tussen de Basis Afdeling Geneeskunde en de Hematologie Dienst van het Hospital de Clínicas, met als doel de aanwezigheid van deze mutatie vast te stellen bij 100 patiënten met BCR-ABL-negatieve PMS.
De recente identificatie van de activerende V617F mutatie in het JAK2 gen betekent een belangrijke vooruitgang in de kennis van de pathogenese van BCR-ABL-negatieve myeloproliferatieve syndromen. Gezien de hoge frequentie waarmee deze mutatie wordt aangetroffen in PV en in mindere mate in ET en IM, is verondersteld dat de opsporing van deze mutatie een grote invloed zou hebben op de diagnose, classificatie en behandeling van deze entiteiten. Verschillende groepen hebben voorgesteld de opsporing van deze mutatie op te nemen als eerstelijns diagnostische test wanneer er een hematocriet van meer dan 51% is of wanneer PV wordt vermoed, aangezien de opsporing van JAK2 V617F een 100% positieve voorspellende waarde heeft voor de diagnose van PV(8,9). Anderzijds hebben verschillende auteurs gesteld dat de aanwezigheid van deze mutatie een nieuwe classificatie van PMS mogelijk zou maken, aangezien ET, PV en MI met de JAK2 mutatie dezelfde ziekte in verschillende evolutionaire stadia zouden kunnen vertegenwoordigen in plaats van verschillende entiteiten(10-12). De precieze klinische waarde en voordelen van de opsporing van deze mutatie moeten echter nog worden vastgesteld en vereisen speciaal opgezette prospectieve klinische trials om deze vragen op te lossen.
Daarnaast opent de ontdekking van deze mutatie nieuwe perspectieven voor therapieën die specifiek gericht zijn tegen het gemuteerde eiwit-kinase, vergelijkbaar met BCR-ABL-remmers bij chronische myeloïde leukemieën.
Samenvatting
Polycythemia vera (PV), essentiële trombocythemie (ET-TE) en idiopathische myelofibrose (IM-MI) zijn klonale myeloproliferatieve aandoeningen die worden gekenmerkt door een overmatige proliferatie van een of meer myeloïdlijnen zoals erytrocyten, trombocyten en fibroblasten van het beenmerg.
Een nauwkeurige categorisering van myeloproliferatieve syndromen moet nog worden besproken, ook al zijn de diagnostische criteria strikt; bovendien zijn deze aandoeningen moeilijk te onderscheiden van reactieve processen.
Recentelijk, in 2005, werd JAK2-mutatie geïdentificeerd in veel van deze entiteiten. Sequencing van de coderende regio van JAK2 onthulde een G naar T transversie op positie 1849, die een valine veranderde in een fenylalanine (JAK2 V617F).
De incidentie van V617F-JAK2-mutatie was bijna 90% bij patiënten met PV, en 50% bij patiënten met IM en ET.
In deze studie beschrijven we de detectie van de V617F-JAK2-mutatie in een patiënt die verdacht werd van PV met behulp van allelspecifieke polymerasekettingreactie-analyse (PCR) en bespreken we het belang van de mutatie voor de diagnose en behandeling van negatieve BCR-ABL myeloproliferatieve syndromen.
Résumé
La polycytémie vera (PV), Essentiële trombocythemie (ET) en idiopathische myelofibrose (IM) zijn nauw verwante klonale myeloproliferatieve aandoeningen die worden gekenmerkt door overmatige proliferatie van een of meer myeloïde lijnen zoals erytrocyten, bloedplaatjes en beenmergfibroblasten.
Hoewel er strikte criteria zijn voor de diagnose van deze myeloproliferatieve syndromen, blijft de precieze categorisering een punt van discussie en bovendien zijn deze aandoeningen in verschillende gevallen moeilijk te onderscheiden van reactieve processen.
Recentelijk, in 2005, werd bij verscheidene van deze entiteiten een mutatie in het tyrosinekinasegen Janus kinase 2 (JAK2) vastgesteld. Deze mutatie bestaat uit de vervanging van een G door een T op positie 1849, waardoor in het eiwit een fenylalanine door valine wordt vervangen (JAK2 V617F).
De incidentie van deze mutatie is waargenomen in bijna 90% van de gevallen met PV en in ongeveer 50% van de gevallen met MI en TE.
In dit werk beschrijven wij de detectie van deze mutatie bij een patiënt met een diagnose van waarschijnlijke PV door middel van een allelspecifieke polymerasekettingreactie (PCR) assay met hoge gevoeligheid voor de detectie van deze mutatie en bespreken wij het belang van deze nieuw ontdekte mutatie voor de diagnose en behandeling van BCR-ABL-negatieve myeloproliferatieve syndromen.
Resumo
A Policitemia Vera (PV), a trombocitemia hemorrágica (TE) e a mielofibrose idiopática (MI) são transtornos mieloproliferativos clonais fortemente relacionados e caracterizados por uma proliferação excessiva de uma ou mais línhas mielóides tais como eritrócitos, platequetas e fibroblastos da medula óssea.
Ondanks het bestaan van strenge criteria voor de diagnose van deze mieloproliferativas, blijft de precieze classificatie een punt van discussie; vaak is het moeilijk om deze distúrbios te onderscheiden van de reativos processen.
In 2005 werd bij een aantal van deze entiteiten een mutatie in het gen tyrosinekinase Janus kinase 2 (JAK2) vastgesteld. In deze mutatie wordt een G naar T substitutie waargenomen op positie 1849, die leidt tot een fenylalanine naar valine substitutie (JAK2 V617F) in het eiwit.
Deze mutatie werd waargenomen in ongeveer 90% van de gevallen met PV en in ongeveer 50% van de gevallen met MI en TE.
In dit artikel beschrijven wij de detectie van deze mutatie bij een patiënt met een waarschijnlijke diagnose van PV met behulp van een zeer gevoelige allelspecifieke polymerase kettingreactie (PCR) assay voor de detectie van deze mutatie en bespreken wij het belang van deze nieuw ontdekte mutatie bij de diagnose en behandeling van BCR-ABL-negatieve myeloproliferatieve syndromen.
Bibliografie
1. Baxter EJ, Scott LM, Campbell PJ, East C, Fourouclas N, Swanton S, et al. Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders. Lancet 2005; 365: 1054-61.
2. James C, Ugo V, Le Couedic JP, Staerk J, Delhommeau F, Layout C, et al. A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signaling causes polycythaemia vera. Nature 2005; 434: 1144-8.
3. Kralovics R, Passamonti F, Buser AS, Teo SS, Tiedt R, Passweg JR, et al. A gain of function mutation in JAK2 is frequently found in patients with myeloproliferative disorders. N Engl J Med 2005; 352: 1779-90.
4. Levine RL, Waldleigh M, Cools J, Ebert BL, Werning G, Huntly BJ, et al. Activating mutation in the tyrosine kinase JAK2 in polycythaemia vera, essential thrombocythemia, and myeloid metaplasia with myelofibrosis. Cancer Cell 2005; 7: 387-97.
6. Vainshenker W, Constantinescu SN. Een unieke activeringsmutatie in JAK2 (V617F) ligt aan de basis van Polycythemia Vera en maakt een nieuwe classificatie van myeloproliferatieve ziekten mogelijk. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2005; 195-200.
7. Sambrook J, Russell DW. Molecular cloning: a laboratory manual. 3 ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 2001.
8. Tefferi A, Pardanani A. Mutatie screening voor JAK2V617F: wanneer de test te bestellen en hoe de resultaten te interpreteren. Leuk Res 2006; 30(6): 739-44.
9. James C, Delhommeau F, Marzac C, Teyssandier I, Couedic JP, Giraudier S, et al. Detection of JAK2 V617F as a first intention diagnostic test for erythrocytosis. Leukemie 2006; 20: 350-3.
10. Campbell PJ, Scott LM, Buck G, Wheatley K, East CL, Marsden JT, et al. Definition of subtypes of essential thrombocythaemia and relation to polycythaemia vera based on JAK2 V617F mutation status: a prospective study. Lancet 2005; 366: 1945-53.
11. Antonioli E, Guglielmelli P, Pancrazzi A, Bogani C, Verrucci M, Ponziani V, et al. Clinical implications of the JAK2 V617F mutation in essential thrombocythemia. Leukemie 2005; 19: 1847-9.