Cell Biology@Yale

College-inhoud

Membraangebonden organellen

Eukaryote cellen bevatten verzamelingen eiwitten die als een eenheid functioneren, organellen genaamd. Sommige van deze organellen zijn omgeven door een membraan dat qua structuur lijkt op het celmembraan, maar met een andere samenstelling van eiwit en fosfolipide.

Membraangebonden organellen bieden eukaryote cellen verschillende voordelen. Ten eerste kunnen cellen enzymen en reactanten concentreren en isoleren in een kleiner volume, waardoor de snelheid en efficiëntie van chemische reacties toenemen. Ten tweede kunnen cellen potentieel schadelijke eiwitten en moleculen opsluiten in membraangebonden organellen, waardoor de rest van de cellen wordt beschermd tegen hun schadelijke effecten. Zo bevat het lysosoom, een membraangebonden organel, veel enzymen die eiwitten, nucleïnezuren en lipiden verteren. Als deze enzymen in het cytosol zouden vrijkomen, zouden zij de eiwitten, nucleïnezuren en lipiden van de cel kunnen verteren, wat tot celdood zou leiden. Het membraan rond het lysosoom houdt die verterende enzymen weg van de rest van de cel.

Microtubule Organization of Cytoplasm

Organellen en eiwitten zijn meestal niet willekeurig over de cel verdeeld, maar worden georganiseerd door ze te lokaliseren naar gebieden waar ze nodig zijn. De cel maakt gebruik van microtubuli en motoreiwitten om organellen te helpen lokaliseren. Microtubuli zijn lange filamenten die zich door het hele cytoplasma uitstrekken. Twee soorten motoreiwitten, kinesines en dyneins, lopen langs microtubuli en genereren kracht om organellen door het cytoplasma te trekken.

Microtubuli zijn polymeren van een heterodimeer van alfa- en betatubulline. Tubuline polymeriseert tot lineaire protofilamenten en een microtubule bevat 13 protofilamenten die in een cilinder met een holle kern zijn gerangschikt. Microtubuli zijn gepolariseerd in een min- en een plus-uiteinde. Microtubuli groeien vanaf hun plus-uiteinden door meer tubulinesubeenheden toe te voegen. De min-uiteinden van microtubuli zijn onstabiel en worden gestabiliseerd door eiwitten in het microtubule organizing center (MTOC). Als het MTOC zich in het centrum van een cel bevindt, stralen microtubuli met hun plus-uiteinden naar buiten in de richting van het plasmamembraan

Kinesinesines en dyneins lopen langs microtubuli door gebruik te maken van de energie uit ATP-hydrolyse. Beide groepen eiwitten bevatten motordomeinen die zich aan microtubuli binden en ATP hydrolyseren. De motordomeinen zorgen voor beweging langs de microtubuli. De meeste kinesines lopen naar het plus-uiteinde van microtubuli, terwijl dyneïne naar het min-uiteinde loopt. Dit geeft cellen twee instrumenten om de verdeling van organellen langs microtubuli te regelen. Kinesines en dyneines bevatten ook een lading-bindend domein dat hen verbindt met verschillende organellen. Kinesines vormen een grote familie van eiwitten en het ladingbindende domein is het meest divergente, waardoor verschillende leden van de kinesine-familie verschillende organellen kunnen binden. Dyneïne is een groot complex van verschillende eiwitten en hoe het lading bindt is minder duidelijk.

Actinefilamenten ondersteunen ook het transport van cellulair materiaal, maar over veel kortere afstanden dan microtubuli. Actinefilamenten bestaan uit een polymeer van actine, een klein bolvormig eiwit. Het actinefilament is een spiraalvormige array van actine en heeft net als microtubuli een plus- en een minkant, waarbij de filamenten gemakkelijker groeien vanaf hun plusuiteinden. Actinefilamenten hebben niet de uitgebreide laterale contacten van microtubuli en zijn gewoonlijk veel korter dan microtubuli. Actinefilamenten hebben de neiging zich te lokaliseren in de buurt van het celmembraan, waar zij structurele steun bieden.

Myosines zijn een klasse motoreiwitten die kracht kunnen genereren langs actinefilamenten. Sommige myosines zijn betrokken bij het samentrekken van cellen (d.w.z. het samentrekken van spieren), terwijl andere de beweging en positionering van organellen ondersteunen. Klasse V-myosines zijn betrokken bij het transport van organellen in verschillende celtypen. Net als de structuur van kinesine bevatten klasse V-myosines een motordomein dat actinefilamenten bindt en de energie van ATP-hydrolyse gebruikt om langs de filamenten te lopen. De C-terminus van myosine V bindt organellen.

Om organellen te transporteren en te positioneren, maken cellen vaak gebruik van zowel microtubuli als actinefilamenten. Microtubuli, kinesines en dyneins worden gebruikt om organellen over lange afstanden (enkele microns of meer) te verplaatsen, terwijl actinefilamenten organellen over korte afstanden transporteren (b.v. in de buurt van het plasmamembraan). Vaak bevat een organel meer dan één type motoreiwit (b.v. kinesine en myosine V) om cellen in staat te stellen beide sets filamenten te gebruiken om het organel te positioneren.

Signaalreeksen

Om de identiteit en functie van de verschillende organellen en het plasmamembraan in stand te houden, moeten cellen specifieke eiwitten richten op organellen en andere intracellulaire compartimenten. De meeste van deze eiwitten bevatten een korte sequentie, signaalsequentie genaamd, die hun intracellulaire locatie bepaalt. Signaalsequenties kunnen overal in een eiwit gelokaliseerd zijn, maar worden vaak gevonden in de N-terminus. Signaalsequenties die eiwitten naar dezelfde organelle leiden, hebben vaak niet dezelfde primaire sequentie. Het zijn gewoonlijk de algemene biochemische eigenschappen van de sequentie die bepalen of een eiwit naar een organel wordt geleid. Signaalsequenties worden gebruikt om zowel oplosbare eiwitten als integrale membraaneiwitten te importeren.

Eiwitten importeren in membraangebonden organellen

Omdat de membranen die organellen omgeven de doorgang van eiwitten beperken, hebben organellen verschillende mechanismen ontwikkeld voor het importeren van eiwitten uit het cytoplasma. De meeste organellen bevatten een aantal membraaneiwitten die een porie vormen. Deze porie maakt de passage mogelijk van eiwitten met de juiste signaalvolgorde. Sommige poriën (ER, mitochondria) kunnen alleen ongevouwen eiwitten doorlaten, terwijl andere poriën (kern, peroxisoom) gevouwen eiwitten doorlaten.

Eiwitten naar het endoplasmatisch reticulum

Eiwitten die bestemd zijn voor secretie, het plasmamembraan of een ander organel van de secretieroute worden eerst in het ER ingebracht. De meeste eiwitten passeren het ER co-translationeel, omdat ze door ribosomen op het ER worden gesynthetiseerd. Zowel oplosbare eiwitten (eiwitten die zich in het lumen van organellen bevinden of worden gesecreteerd) als integrale membraaneiwitten worden naar het ER getranslokeerd via hetzelfde mechanisme.

De signaalsequentie voor ER-eiwitten bevindt zich meestal aan de N-terminus. Het signaalherkenningsdeeltje (SRP), een complex van 6 eiwitten en een RNA, bindt de signaalsequentie onmiddellijk nadat deze is vertaald. Het SRP heeft ook een wisselwerking met het ribosoom en stopt de translatie. Het oppervlak van ER membranen bevat een receptor voor SRP. De SRP-receptor rekruteert SRP, nascent ER-eiwit, en ribosoom naar het ER. De SRP-receptor bevrijdt het SRP van de signaalsequentie en laat de translatie op het ER-membraan doorgaan.

Ribosomen op het ER-membraan binden zich aan de eiwittranslocator. De translocator is een transmembraaneiwit dat een waterige porie vormt. De porie is het kanaal waardoor de nieuw gesynthetiseerde ER eiwitten over het ER membraan worden getranslokeerd. Vertaling van het ER eiwit genereert de “kracht” om het ER eiwit door het kanaal te duwen.

Oplosbare eiwitten worden volledig door het kanaal getranslokeerd; de signaalsequentie blijft in het kanaal en wordt door een protease in het lumen van het ER van de rest van het eiwit gescheiden.

Integrale membraaneiwitten bevatten een stop-overdrachtsequentie stroomafwaarts van de signaalsequentie. De stop-transfer-sequentie stopt de translocatie door het kanaal en het gedeelte van het eiwit na de stop-transfer-sequentie blijft buiten het ER. Integrale membraaneiwitten kunnen zodanig worden getranslokeerd dat ofwel hun N-terminus ofwel hun C-terminus zich in het lumen van het ER bevindt. Eiwitten met hun C-terminus in het lumen hebben meestal een interne signaalsequentie. De translocator lijkt aan één kant open te gaan zodat integrale membraaneiwitten in de omringende lipide bilaag kunnen diffunderen.

Sommige eiwitten overspannen het membraan meerdere malen en deze eiwitten bevatten na de stop-transfer-sequentie een start-transfer-sequentie die de translocatie van het eiwit door het kanaal opnieuw initieert. Een eiwit met een signaal-sequentie, stop-overdracht en start-overdracht zou het membraan tweemaal overspannen met een lus die in het cytosol of lumen verblijft. Om eiwitten te genereren die het membraan meerdere malen overspannen, zou het eiwit meerdere afwisselende stop- en stertransfer-sequenties moeten hebben.

Eenmaal in het ER vouwen eiwitten zich in hun driedimensionale structuren. Er bestaan verschillende mechanismen om eiwitten te helpen vouwen, waaronder chaperonnonen en glycosylering. Het ER bevat ook mechanismen om eiwitten te behandelen die er niet in slagen zich te vouwen.

Eiwitten in Mitochondriën

Hoewel mitochondriën hun eigen genoom bevatten, worden de meeste mitochondriale eiwitten gecodeerd door nucleaire genen, waardoor een mechanisme nodig is om deze eiwitten in mitochondriën op te sporen en in te voeren. Net als eiwitten die in de ER worden geïmporteerd, bevatten mitochondriale eiwitten een signaalsequentie die hen naar de mitochondriën lokaliseert. In tegenstelling tot ER eiwitten, worden mitochondriale eiwitten post-translationeel geïmporteerd. Omdat eiwitten ontvouwen moeten zijn om door kanalen in het mitochondriale membraan te kunnen transloceren, worden mitochondriale eiwitten ontvouwd in het cytosol gehouden door chaperonen.

De import van eiwitten in mitochondriën is vergelijkbaar met de import in de ER, maar wordt bemoeilijkt door de aanwezigheid van twee membranen rond mitochondriën. Mitochondriale eiwitten kunnen zich bevinden in het buitenmembraan, binnenmembraan, intermembraanruimte, of matrix (ruimte binnenin het binnenmembraan).Daarom hebben mitochondriën translocatoren die de passage van eiwitten over het buitenmembraan en over het binnenmembraan mogelijk maken. Het TOM-complex zorgt voor de passage over het buitenmembraan, terwijl het TIM-complex zorgt voor de passage over het binnenmembraan.

Translocatie van eiwitten in Mitochondria

De signaalsequentie die eiwitten naar de matrix stuurt, bevindt zich meestal aan de N-terminus. De signaalsequentie wordt herkend door eiwitten in het TOM-complex. Het TOM-complex brengt de eiwitten naar de binnenste membraanruimte, waar het TIM-complex in het binnenste membraan het eiwit naar de matrix brengt. Het TOM- en TIM-complex werken vaak samen om een eiwit over beide membranen te transloceren. De translocatie over de mitochondriale membranen is afhankelijk van energie. Chaperones in de matrix helpen het eiwit over het binnenste membraan te “trekken” en hebben ATP-hydrolyse nodig om te functioneren. De eiwitten vouwen binnen de matrix.

Eiwitten die naar het binnenmembraan worden geleid, gebruiken een soortgelijk mechanisme als matrixeiwitten, maar bevatten een stop-overdrachtsequentie die door het TIM-complex wordt herkend. Eiwitten die bestemd zijn voor het buitenmembraan worden over het buitenmembraan getranslokeerd naar de intermembraanruimte en vervolgens in het buitenmembraan geïmporteerd door de SAM translocator. Eiwitten die bestemd zijn voor de intermembraanruimte worden gedeeltelijk in de binnenmembraanruimte opgenomen en vervolgens door een protease gesplitst en in de binnenmembraanruimte vrijgegeven.

Import en export van nucleaire eiwitten

In tegenstelling tot de ER en mitochondriën importeert de kern voornamelijk oplosbare eiwitten. Bovendien pendelen eiwitten vaak tussen de kern en het cytoplasma en gebruikt de cel de nucleaire import/export om verschillende kritieke biochemische routes te reguleren. De kern is omgeven door twee membranen en in deze membranen zijn duizenden kernporiën ingebed waardoor eiwitten en andere macromoleculen (RNA, ribsosomen) de kern binnenkomen en verlaten. De kernporiën worden in de membranen gestabiliseerd door lamines, een cytoskeletaal netwerk dat onder het binnenste kernmembraan ligt en dat structurele steun aan het membraan biedt. De kernporie beperkt de doorgang van materiaal op basis van grootte: dingen kleiner dan ~ 30 kD diffunderen vrij door de porie, maar grote moleculen hebben een manier nodig om erin en eruit te komen. Eiwitten die de kern binnenkomen, bevatten een nucleair importsignaal en eiwitten die de kern ook weer moeten verlaten, bevatten een nucleaire exportsequentie.

Verschil cytoplasma van kern

Om gericht transport van eiwitten in en uit de kern te bewerkstelligen, moeten eiwitten weten of ze zich in het cytoplasma of in de kern bevinden. Om onderscheid te maken tussen de kern en het cytoplasma, gebruiken cellen een klein GTP-bindend eiwit, Ran genaamd. Zoals alle GTP-bindende proteïnen, bestaat Ran ofwel in een GTP-gebonden toestand of in een GDP-gebonden toestand. Twee eiwitten katalyseren de omschakeling tussen deze toestanden. Ran-GAP (GTPase activating protein) katalyseert GTP-hydrolyse waardoor Ran-GDP ontstaat. Ran-GEF (guanine nucleotide exchange factor) katalyseert het vrijkomen van GDP en het opnieuw binden van GTP, waardoor Ran-GTP wordt gegenereerd. Ran-GAP lokaliseert zich aan de cytoplasmatische zijde van de kernpoorten, terwijl Ran-GEF met chromatine associeert en zich daarom in de kern lokaliseert. Als gevolg hiervan is het meeste Ran in de kern gebonden aan GTP en het meeste Ran in het cytoplasma aan GDP.

Nucleaire Import

Receptoren (importins) binden nucleaire import-sequenties in eiwitten. Importins hebben ook een wisselwerking met filamenten die zich uitstrekken aan de cytoplasmatische kant van nucleaire poriën. Via een onbekend mechanisme verplaatsen importins, gebonden aan hun lading, zich door de nucleaire porie. Binnen de porie komt het importine-cargo-complex in aanraking met Ran-GTP. Ran-GTP scheidt importins van de lading, waardoor lading-eiwitten vrijkomen om hun werk in de kern te doen.

Nucleaire export

Veel eiwitten die de kern binnenkomen moeten worden geëxporteerd naar het cytoplasma (b.v. importins). Deze eiwitten bevatten een nucleaire exportsequentie die een interactie aangaat met een receptor, exportine genaamd. Ran-GTP bindt aan dit exportin-cargo complex en stabiliseert de interactie. Het exportin-cargo-RanGTP complex verplaatst zich door de porie (mechanisme onduidelijk) waar het Ran-GAP ontmoet aan de cytoplasmatische zijde. Ran-GAP zet Ran-GTP om in Ran-GDP waardoor exportine loskomt van zijn lading.

Import van eiwitten in peroxisomen en het syndroom van Zelleweger

Peroxisomen zijn kleine organellen (~ 1 µm in diameter) die een verscheidenheid aan functies voor cellen vervullen. Peroxisomen metaboliseren schadelijke chemicaliën (fenolen, formaldehyde, ethanol), metaboliseren vetzuren, en katalyseren een stap in de synthese van plasmalogen, een lipide die in myeline wordt aangetroffen.

Eiwitten die bestemd zijn voor peroxisomen bevatten een signaalsequentie die wordt herkend door een familie van eiwitten die Pex-eiwitten worden genoemd. Sommige van deze Pex-eiwitten binden aan signaalreeksen, terwijl andere voor een porie in het membraan van peroxisomen zorgen die de toegang van peroxisome eiwitten mogelijk maakt.

Cellen die mutaties in Pex-eiwitten bevatten, kunnen geen eiwitten in peroxisomen importeren en als gevolg daarvan hebben deze cellen geen peroxisomen. Mutaties in Pex-eiwitten worden in verband gebracht met een reeks ziekten die het syndroom van Zelleweger wordt genoemd. Bij het Zelleweger-syndroom hebben zuigelingen geen spiertonus en vaak ook niet het vermogen om te zogen. De zuigelingen vertonen ook craniofaciale afwijkingen en een vergrote lever. De prognose voor baby’s die aan het syndroom van Zelleweger lijden is slecht; de meeste overleven niet langer dan een jaar.

Omdat peroxisomen bijdragen aan de synthese van een lipide die in myeline wordt aangetroffen, vertonen patiënten met Zelleweger vaak een slechte myelinisatie van neuronen. Myelinisatie is van cruciaal belang voor de functie van neuronen bij het geleiden van signalen naar doelcellen.