Langfristige Steigerung der Skelettmuskelmasse und -kraft durch die Verabreichung einzelner Gene von Myostatin-Inhibitoren

Ergebnisse und Diskussion

AAV-vermittelte Genverabreichung an Muskeln bietet ein System zur Erzeugung hoher Proteinmengen im Zielgewebe oder durch ein sekretiertes Produkt, das über den Blutkreislauf an entfernte Orte getragen wird (19). Wir haben die bekannten sekretierten Myostatin-hemmenden Gene, darunter das mit dem Wachstums- und Differenzierungsfaktor assoziierte Serumprotein-1 (GASP-1) (18), das Follistatin-verwandte Gen (FLRG) (17) und das Follistatin-344 (FS) (13) in den AAV-Serotyp 1 kloniert, die eine hohe Fähigkeit zur Muskeltransduktion gezeigt haben. Es gibt zwei Isoformen von Follistatin, die durch alternatives Spleißen entstehen. Die FS-344-Variante wird durch Peptidspaltung in die FS-315-Isoform umgewandelt, während die andere FS-317-Variante nach Peptidspaltung die FS-288-Isoform erzeugt. Wir haben die menschliche FS-344-Variante verwendet, die ausschließlich die im Serum zirkulierende FS-315-Isoform von FS erzeugt und eine C-terminale saure Region enthält (20). Wir haben uns für FS-344 (FS) entschieden, weil die andere FS-317-Isoform, der der C-Terminus fehlt, eine bevorzugte Lokalisierung in der Follikelflüssigkeit der Eierstöcke und eine hohe Gewebebindungsaffinität durch Heparinsulfat-Proteoglykane aufweist, was die Fortpflanzungsfähigkeit beeinträchtigen und an andere Off-Target-Stellen binden kann (21). FS-288 stellt die membrangebundene Form von Follistatin dar (22), ist ein wirksamer Unterdrücker des hypophysären follikelstimulierenden Hormons (23), kommt in der Follikelflüssigkeit des Eierstocks und in den Hoden vor und weist eine hohe Affinität zu den Granulosazellen des Eierstocks auf.

Wir wollten die Wirksamkeit dieser Proteine zur Steigerung der Muskelmasse in normalen und dystrophischen Mäusen bestimmen. Wir verabreichten 1 × 1011 AAV1-Viruspartikel pro Tier, die für FS, FLRG, GASP-1 oder GFP kodieren, beidseitig in die Quadrizeps- und Tibialis-anterior-Muskeln von 4 Wochen alten Wildtyp-C57BL/6-Mäusen. Alle mit den Myostatin-Inhibitoren behandelten Tiere zeigten bei der Analyse im Alter von 725 Tagen im Vergleich zu den mit GFP behandelten Kontrolltieren eine Zunahme der Körpermasse und eine sichtbare Vergrößerung der Muskeln (Abb. 1 a und b). Die Auswertung der einzelnen Muskelgewichte zeigte eine Zunahme der Muskelmasse bei allen mit Myostatin-Inhibitoren behandelten Tieren, wobei die Zunahme bei den mit FS behandelten Tieren am größten war. Die erhöhte Muskelmasse wurde in den injizierten Muskeln der Hintergliedmaßen und in den von der Injektionsstelle entfernten Muskeln, wie dem Trizeps, festgestellt. Diese Inhibitoren wurden also von der Injektionsstelle aus in den Blutkreislauf abgegeben, wodurch die Skelettmuskelmasse an entfernten Stellen zunahm (Abb. 1 c). Die vergrößerte Muskelmasse ging mit einer funktionellen Verbesserung einher, die sich in einer Zunahme der Griffkraft der Hintergliedmaßen zeigte (Abb. 1 d). Es gab keine Auswirkungen auf die Herzmasse oder das histologische Erscheinungsbild der Kardiomyozyten, was darauf hindeutet, dass die Myostatinhemmung selektiv auf das Skelettmuskelgewebe wirkt (Daten nicht gezeigt). Es wurde befürchtet, dass sich FS negativ auf die Funktion der Keimdrüsen auswirkt. Bei Mäusen, die mit unserem AAV1, das das FS344-Transgen trägt (AAV1-FS, Tabelle 1), behandelt wurden, konnten wir keine Veränderung der Fortpflanzungsfähigkeit feststellen. Außerdem fanden wir keine histologischen/pathologischen Veränderungen im Keimdrüsengewebe der mit FS behandelten Mäuse im Vergleich zu den Kontrollen (Daten nicht gezeigt).

Angesichts der robusten Wirkungen der FS-Verabreichung testeten wir als Nächstes das Potenzial von AAV1-FS, das postnatal in einem klinisch sinnvollen Paradigma verabreicht wird, um die Muskelmasse und -kraft zu erhöhen und den Muskelabbau im mdx-Mausmodell der Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) zu verzögern. DMD ist eine X-chromosomal rezessiv vererbte Krankheit, die zu einer Schwächung der Skelettmuskulatur und der Herzfunktion und schließlich zum Tod führt. Vor kurzem wurde die FS in mdx-Tieren untersucht, die eine duplizierte Domäne des Follistatin-Gens überexprimieren. Die Ergebnisse zeigten eine Zunahme der Muskelmasse und eine Abschwächung der Pathologie, obwohl die Ergebnisse nur bis zum Alter von 15 Wochen dokumentiert wurden (24). In unseren Studien wurde mdx-Tieren im Alter von 3 Wochen eine niedrige (1 × 1010 Viruspartikel) oder hohe Dosis (1 × 1011 Viruspartikel) von AAV1-FS beidseitig in den Quadrizeps- und Tibialis-anterior-Muskel injiziert und bis zur Sektion 5 Monate lang verfolgt. Im Serum sowohl der mit niedriger als auch der mit hoher Dosis behandelten Tiere wurden erhöhte Konzentrationen zirkulierender FS nachgewiesen, wobei die hohe Dosis die höchsten Konzentrationen an im Serum nachgewiesenen FS aufwies (hohe Dosis, 15,3 ± 2,1 ng/ml; niedrige Dosis, 6,8 ± 0,4 ng/ml; GFP-Kontrollen, 0 ± 0,1 ng/ml; n = 8 pro Gruppe; P < 0,01). Wir konnten nachweisen, dass AAV1-FS die Körpermasse im Vergleich zu den mit GFP behandelten Kontrollen erhöhte, wobei die größte Zunahme in der hochdosierten FS-Gruppe zu verzeichnen war (Daten nicht gezeigt). Die grobe Betrachtung der mit AAV1-FS behandelten Mäuse zeigte eine signifikante Zunahme der Muskelgröße im Vergleich zu den mit AAV1-GFP behandelten Tieren (Abb. 2 a), wobei die größte Zunahme des individuellen Muskelgewichts bei den mit hoher FS-Dosis behandelten Tieren zu verzeichnen war (Abb. 2 b). Die Effekte waren nicht auf die injizierten Muskeln beschränkt, sondern wurden auch an Stellen gefunden, die von den direkt betroffenen Muskeln entfernt waren (Abb. 2 b). Die Zunahme der Muskelmasse führte zu einer dosisabhängigen Verbesserung der Muskelkraft in den Hinter- und Vordergliedmaßen der behandelten Tiere im Vergleich zu den mit GFP behandelten Kontrollen (Abb. 2 c). Histologische und morphometrische Analysen von AAV1-FS-injizierten Muskeln und an entfernten Stellen zeigten eine Myofaserhypertrophie, was die groben Beobachtungen zum Zeitpunkt der Sektion bestätigte (Abb. 3 a-c). Darüber hinaus gab es bei den mit AAV-FS behandelten Tieren keine Verschiebung der Muskelfasertypen; allerdings gab es bei den mit der hohen AAV-FS-Dosis behandelten Tieren weniger Gesamtfasern pro Quadratmillimeter Fläche im Tibialis anterior-Muskel (Abb. 3 d und e). Auffallend ist, dass FS-behandelte Mäuse im Vergleich zu GFP-behandelten Kontrollen eine signifikante Verringerung der Serum-Kreatinkinase aufwiesen (Abb. 4 a). Das ist interessant, weil FS eine schützende Wirkung hatte, obwohl es den zugrundeliegenden Dystrophinmangel nicht korrigierte. Der genaue Mechanismus ist nicht klar, aber man könnte vermuten, daß die Erhöhung der Stärke einzelner Fasern sie weniger anfällig für Schäden durch die Belastung bei normalen Aktivitäten macht. Die Beteiligung der Satellitenzellen an der postnatalen Myostatinhemmung muß noch vollständig geklärt werden; wir konnten jedoch keine statistische Veränderung der Muskelsatellitenzellmarker bei FS-behandelten Tieren feststellen (Daten nicht gezeigt).

Wir untersuchten auch das Potenzial von AAV1-FS, die Muskelkraft von mdx-Tieren zu erhöhen, wenn sie in einem höheren Alter behandelt werden. Wir fanden heraus, dass die Injektion von AAV1-FS im Alter von 210 Tagen die Muskelkraft ≈60 Tage nach der Verabreichung steigerte und dass die gesteigerte Kraft während der 560 Tage, die in dieser Studie ausgewertet wurden, langfristig anhielt (Abb. 4 b). Bereits im Alter von 180 Tagen, vor der AAV1-FS-Behandlung, zeigten sich in den Muskeln der unbehandelten mdx-Tiere deutliche pathologische Veränderungen mit einer ausgeprägten endomysialen Bindegewebswucherung und Entzündung (Abb. 4 c und d). Die pathologische Auswertung der Gastrocnemius- und Zwerchfellmuskeln im Alter von 560 Tagen zeigte, dass die mit AAV1-FS behandelten Tiere wesentlich weniger fokale Gruppen nekrotischer Muskelfasern und mononukleäre Zellinfiltrate aufwiesen. Wichtig ist, dass AAV1-FS-behandelte Tiere deutlich weniger fokale Bereiche mit endomysialer Bindegewebswucherung aufwiesen, die bei GFP-behandelten Tieren ausgeprägt waren, was zeigt, dass die Fibrose, ein Kennzeichen der Muskeldystrophie, bei FS-behandelten Tieren verringert war (Abb. 4 c). Die Pathologie im Zwerchfell zeigte ebenfalls, dass die FS-Behandlung im Vergleich zu GFP-behandelten Tieren die Entzündung und den Fettaustausch reduzierte (Abb. 4 d). Darüber hinaus zeigte die AAV1-FS-Behandlung eine signifikante Zunahme des Muskelfaserdurchmessers in diesem Alter im Vergleich zu GFP-behandelten Tieren (Abb. 4 c und d). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Hemmung von Myostatin durch FS-Behandlung bei älteren mdx-Tieren, die mehrere Runden der Muskeldegeneration und -regeneration durchlaufen haben, von Vorteil ist. Die Übertragung auf eine klinische Parallele deutet darauf hin, dass die AAV-vermittelte FS-Gentherapie ein Potenzial für ältere DMD-Patienten haben könnte, unabhängig vom Ersatz des fehlenden Gens, und dass sie eine potenzielle Rolle in der Kombinationstherapie spielen könnte, ähnlich wie beim Ersatz von IGF-1- und Minidystrophin-Genen (25).

Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Hemmung von Myostatin durch FS-344, verabreicht durch eine einzige AAV1-Injektion, die Muskelgröße und -stärke verbessern kann und für >2 Jahre gut verträglich ist. Die Ergebnisse von FS344 stellen möglicherweise eine wirkungsvollere Strategie dar als andere, die nur auf Myostatin abzielen, da es zusätzliche Wirkungen hat, wie z. B. die Beteiligung von Follistatin an mehreren Signalwegen, und die jüngste Erkenntnis, die eine Verringerung der Entzündung in einem Modell der Endotoxämie zeigt (15, 26). Die bemerkenswerte Fähigkeit von FS, dystrophische Muskeln in alten Tieren langfristig grob und funktionell zu verbessern, rechtfertigt seine Erwägung für die klinische Entwicklung zur Behandlung von Erkrankungen des Bewegungsapparats, einschließlich älterer DMD-Patienten.