Rolle von Candida bei Antibiotika-assoziierter Diarrhö

Abstract

Um die Rolle von Candida-Arten bei Antibiotika-assoziierter Diarrhö (AAD) quantitativ zu bewerten, wurden Stuhlproben von insgesamt 395 Patienten und Kontrollpersonen in einem differenzierten Isolationsmedium angezüchtet: 98 Patienten hatten AAD, 93 Patienten nahmen Antibiotika ein, hatten aber keine Diarrhöe (A+D-), 97 Patienten nahmen keine Antibiotika ein, hatten aber Diarrhöe (A-D+), und 107 Patienten waren Kontrollpersonen (A-D-). Darüber hinaus wurde die Produktion von sekretierter Aspartylproteinase (Sap) getestet. Bei den AAD-Patienten unterschieden sich die Candida-Positivität (77/98) und die Candida-Überwucherung (62/98) nicht von denen der A+D- Patienten (75/93 bzw. 52/93). Die Candida-Überwucherung war bei A-D+-Patienten (40/97, P=.003) weniger häufig als bei AAD-Patienten, aber die Candida-Positivität unterschied sich nicht (80/97, P=.612). Bei den Kontrollpersonen waren Candida-Positivität und Überwucherung seltener als in allen anderen Gruppen. Die Produktion von Sap unterschied sich nicht zwischen Patienten mit AAD und Kontrollpersonen (P=.568 bzw. P=.590). Die Daten deuten darauf hin, dass erhöhte Candida-Zahlen eher eine Folge der Antibiotikabehandlung oder der Diarrhöe als eine Ursache der AAD sind

Mundsoor und Ösophagitis sind die häufigsten pathologischen Manifestationen von Candida-Infektionen. Die Rolle von Candida bei Antibiotika-assoziierter Diarrhö (AAD) ist umstritten. Man geht davon aus, dass fäkale Konzentrationen von Candida-Spezies von ⩾105 cfu/ml im Stuhl bei Patienten nach einer Antibiotikatherapie Durchfall verursachen. Es wurde berichtet, dass Patienten, die Antibiotika erhielten, ohne Durchfall zu entwickeln, <105 cfu Candida-Pilze/ml Stuhl aufwiesen

Sekretierte Aspartylproteinasen (Saps) sind wichtige Virulenzfaktoren, die von Candida-Arten produziert werden. Saps sind an der Anhaftung von Candida albicans an die menschliche Schleimhaut und an der Invasion von menschlichem Gewebe beteiligt. Ein Zusammenhang zwischen der Expression von Saps und der Virulenz von Candida wurde bei der oralen Candidose und der Candida-Vaginitis bei mit dem Humanen Immundefizienz-Virus (HIV) infizierten Patienten nachgewiesen. Bei Candida-bedingter AAD wird eine aktive Sekretion durch ein Pilztoxin oder toxinähnliche Substanzen als pathogenetischer Mechanismus für die Diarrhöe diskutiert. Bei C. albicans sind 10 verschiedene SAP-Gene identifiziert worden. Bei Candida tropicalis wurde eine schwache extrazelluläre proteolytische Aktivität beobachtet, während Candida glabrata auf Proteinagar keine proteolytische Aktivität aufweist

C. albicans ist dafür bekannt, dass er Aspartylproteinasen produziert, wenn er in einem Medium mit Protein als einziger Stickstoffquelle gezüchtet wird, und die Expression des SAP2-Gens ist hauptsächlich für die proteolytische Aktivität verantwortlich, die bei den meisten Stämmen beobachtet wird, die in vitro in der Hefeform wachsen. SAPs zeigen auch proteolytische Aktivität im Gastrointestinaltrakt; SAP-Expression bei oraler Candidose und Abbau von gastrointestinalem Mucin durch SAPs wurde nachgewiesen. Der Abbau von Magen-Darm-Schleim durch Enzyme wurde als Virulenzdeterminante für eine Reihe von Enteropathogenen (z. B. Vibrio cholerae, Shigella-Arten, Helicobacter pylori und Yersinia enterocolitica) identifiziert. Bei C. albicans, der Schleimhautoberflächen besiedelt, kann der Muzinabbau durch SAP2 eine engere Annäherung an die Epithelzellen und/oder eine Veränderung der Zelloberflächen ermöglichen. Bei Kindern mit akutem und chronischem Durchfall wurden höhere Konzentrationen an sekretorischer Candida-Säureproteinase gefunden als bei gesunden Kontrollpersonen

Um die pathogenetische Relevanz von Candida-Spezies bei erwachsenen Patienten mit AAD zu klären, haben wir bei 395 immunkompetenten Erwachsenen quantitative Stuhlkulturen für Candida-Spezies angelegt. Darüber hinaus wurde die Produktion von Saps untersucht

Methoden

Patientenauswahl und Entnahme von StuhlprobenAlle Patienten einer medizinischen Abteilung mit 250 Betten wurden 11 Monate lang täglich auf Durchfall oder auf eine Antibiotikabehandlung bei fehlendem Durchfall untersucht. Durchfall wurde definiert als >3 breiige oder wässrige Stühle pro Tag. Als Antibiotikabehandlung galt die Einnahme von oralen oder intravenösen Antibiotika in therapeutischer Dosierung über ⩾1 Tag. AAD wurde definiert als >3 breiige oder wässrige Stühle pro Tag während oder bis zu 2 Monate nach der Antibiotikabehandlung. Die Patienten wurden nacheinander in 4 Studiengruppen rekrutiert, bis die für den statistischen Vergleich erforderliche Anzahl erreicht war (siehe statistische Analyse unten). Die Patienten wurden nur einmal während ihrer Krankenhauseinweisung aufgenommen

Die Stuhlproben aller Patienten mit Durchfall wurden auf bakterielle Erreger (Salmonellen, Shigellen, Yersinien und Campylobacter) auf Selektivagar kultiviert, auf Eizellen und Parasiten untersucht und auf Clostridium difficile durch Kultur auf Selektivagar und mit Hilfe des C. difficile-Schnelltests (BD) getestet. Patienten mit einem dieser Erreger wurden von der Studie ausgeschlossen. So wurden 395 Patienten (195 mit Durchfall und 200 ohne) in die Studie aufgenommen und in 4 Gruppen eingeteilt: (1) Gruppe A+D+, 98 AAD-Patienten, die Antibiotika erhielten und Durchfall hatten; (2) Gruppe A+D-, 93 Patienten, die Antibiotika erhielten, aber keinen Durchfall hatten; (3) Gruppe A-D+, 97 Patienten, die keine Antibiotika erhielten, aber Durchfall hatten; und (4) Gruppe A-D-, 107 Kontrollpersonen, die keine Antibiotika erhielten und keinen Durchfall hatten

Die 4 Gruppen unterschieden sich nicht in Geschlecht und Altersverteilung. Die Stuhlproben aller Probanden wurden unmittelbar nach dem Stuhlgang entnommen und innerhalb von 15 Minuten in das Labor im selben Gebäude gebracht. Stuhlproben, die in der Nacht abgegeben wurden, wurden bei 4°C gelagert und am nächsten Morgen bearbeitet

Candida-Kulturen und ObjektträgerausstricheDie Stuhlproben wurden 1:10 mit Kochsalzlösung verdünnt, in einem Stuhlhomogenisator gerührt und erneut 1:1000 und 1:10000 mit Kochsalzlösung verdünnt. Einhundert Mikroliter jeder Verdünnung wurden auf einen Candida CHROMagar (BBL) übertragen und mit einem sterilen Tupfer gleichmäßig ausgeplattet. Nach einer 48-stündigen Inkubation bei 37 °C an der Luft wurden die Candida-Kolonien gezählt und anhand der Farbe der Kolonien als C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis oder andere Candida-Arten klassifiziert. Eine Koloniezahl von ⩾105 cfu/ml Stuhl wurde nach Danna et al. als „Candida-Überwucherung“ eingestuft. Von jeder Verdünnung der ersten 100 aufeinanderfolgenden Stuhlproben wurde ein Objektträgerausstrich mit Gram-Färbung angefärbt und lichtmikroskopisch auf das Vorhandensein von Hefepilzen und Leukozyten untersucht

Der Nachweis von SapsDie aufeinanderfolgenden Candida-Isolate aus den Patientengruppen A-D- und A+D+ wurden auf Aspartylproteinase-Sekretion in Rinderserumalbumin (BSA)-Agar (1,17% Hefe-Kohlenstoffbase , 0,01% Hefeextrakt und 0,2% BSA ) getestet, wie an anderer Stelle beschrieben. Das Medium wurde auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt, durch Filtration (Porengröße 0,2 μm) sterilisiert und zu einer Stammlösung von autoklaviertem (2 %) Agar hinzugefügt. Die Proteolyse, die die Enzymaktivität anzeigt, wurde in Millimetern gemessen und wie an anderer Stelle vorgeschlagen bewertet: – oder ± (keine sichtbare oder eine sehr begrenzte Klärung des Agars um die Kolonie herum war vorhanden), 1+ (es wurde eine nennenswerte Proteolyse beobachtet) und 2+ (die Klärung des Agars ging weit über den Rand der Kolonie hinaus). Der C. albicans-Stamm SC5314 und eine SAP2-Nullmutante (zur Verfügung gestellt von B. Hube, Universität Hamburg, Deutschland) wurden als Kontrollen untersucht

Statistische AnalyseDie Anzahl der Patienten mit unterschiedlichen Candida-Zahlen in den verschiedenen Gruppen wurde mit Hilfe des χ2-Tests verglichen, und die Hefezahlen auf Objektträgerausstrichen wurden mit Hilfe der Pearson-Korrelation mit den Candida-Zahlen aus Kulturen korreliert. Die Unterschiede in der Saftproduktion wurden mit dem Student’s t-Test und dem exakten Fisher-Test berechnet. Der Stichprobenumfang für den Kulturtest wurde mit 91 auswertbaren Patienten und für den Sap-Test mit 20 auswertbaren Patienten pro Gruppe berechnet, mit einem α von 0,05 und einer Power von 0,8 (SigmaStat, Version 2.0; Jandel Scientific). Unterschiede mit P<.05 wurden als signifikant angesehen

Ergebnisse

Candida-Kulturen und ObjektträgerabstricheDie Ergebnisse der Candida-Kulturen sind in Abbildung 1 dargestellt. In der Gruppe A+D+ unterschieden sich die Candida-Positivität (bei 77/98 Patienten) und die Candida-Überwucherung (bei 62/98 Patienten) nicht signifikant von denen der Gruppe A+D- (75/93 Patienten bzw. 52/93 Patienten). In der Gruppe A-D+ war die Candida-Überwucherung signifikant seltener als in der Gruppe A+D+ (P=.003), aber die Candida-Positivität unterschied sich nicht signifikant (P=.612). Candida-Positivität und -Überwucherung waren in der Gruppe A-D- signifikant seltener als in allen anderen Gruppen (Candida-Positivität: 66/107 Patienten, P=.013, im Vergleich zu Gruppe A+D+; P=.005, im Vergleich zu Gruppe A+D-; und P=.002, im Vergleich zu Gruppe A-D+; Candida-Überwucherung: 15/107 Patienten, P<.001, verglichen mit allen anderen Gruppen; Abbildung 1)

Exploratorische Analysen unter Verwendung verschiedener Grenzwerte für die Definition von Candida-Überwucherung (103, 104, 106 oder 107 cfu/mL Stuhl) ergaben qualitativ ähnliche Ergebnisse. Bei allen Berechnungen war eine Candida-Überwucherung in den Gruppen A-D- deutlich seltener als in allen anderen Gruppen. C. albicans war das häufigste Isolat (216 von 395 Patienten), gefolgt von C. glabrata (104 von 395 Patienten), C. tropicalis (21 von 395 Patienten), C. krusei (11 von 395 Patienten) und anderen Candida-Arten (97 von 395 Patienten). Candida-Mischkulturen wurden bei 122 (31 %) von 395 Patienten gefunden. Die Hefezahlen auf Objektträgerausstrichen korrelierten nicht mit den Zahlen aus Kulturen (r=.27; Abbildung 2)

Ergebnisse der proteolytischen Aktivität auf BSA-AgarGesamt wurden 23 A+D+ und 20 A-D-Candida-Isolate auf ihre proteolytische Aktivität in BSA-Agar getestet. Die mittlere±SD-Aktivität betrug 1,26±1,06 mm für die A+D+ Gruppe und 1,42±0,64 mm für die A-D- Gruppe. Von den 23 A+D+-Isolaten hatten 16 einen Proteolyse-Score von 1+ (Klärungszone von 1-2 mm) und 1 einen Score von 2+ (Klärungszone von 3-5 mm), was beides auf das Vorhandensein von Proteinase-Enzymaktivität hinweist. Von den 20 A-D-Isolaten hatten 17 einen Proteolyse-Score von 1+ und 2 einen Score von 2+. Alle C. albicans-Isolate zeigten Klärungszonen auf BSA-Medium (⩾1 mm, ⩾1+). In der Gruppe A-D- zeigte 1 C. tropicalis-Isolat keine Proteolyse. In der Gruppe A+D+ zeigten 5 C. glabrata-Isolate und 1 C. tropicalis-Isolat keine Proteolyse. Die Klärungszonen der Gruppen A-D- und A+D+ unterschieden sich nicht signifikant, wenn sie in Millimetern (P=.568, Student’s t test) oder mit dem 1+/2+ Bewertungssystem (P=.294 und P=.590 für Isolate mit der Bewertung 1+ bzw. 2+, Fisher’s exact test) gemessen wurden. Wenn C. glabrata-Isolate (die bekanntermaßen auf Proteinagar negativ sind) entfernt wurden, gab es keinen signifikanten Unterschied in der Sap-Produktion zwischen den Gruppen (P=.347)

Diskussion

Eine Candida-Überwucherung wurde als Ursache für AAD postuliert. Wir untersuchten das Vorhandensein und die Menge von Candida-Arten bei Patienten mit Verdacht auf AAD, bei Patienten ohne Durchfall, die Antibiotika einnahmen, bei Patienten mit Durchfall, die keine Antibiotika einnahmen, und bei Patienten ohne Durchfall, die keine Antibiotika einnahmen (Kontrollpersonen). Ein signifikant höherer Anteil der Stuhlproben von Patienten, die eine antimikrobielle Therapie erhielten und unter Durchfall litten (Gruppe A+D+), war positiv für Candida-Spezies und wies höhere Koloniezahlen auf als Proben von Kontrollpersonen (Gruppe A-D-). In einer Studie von Danna et al. wurde bei 7 (29 %) von 24 AAD-Patienten eine Candida-Überwucherung (⩾105 cfu/mL Stuhl) festgestellt. In dieser Studie wiesen 0 von 24 Patienten ohne Durchfall, die Antibiotika erhielten, eine Candida-Überwucherung auf. In unserer Studie wiesen jedoch 52 (56 %) von 93 Patienten mit Antibiotika, aber ohne Durchfall, eine Candida-Überwucherung auf, und es wurde kein Unterschied zu den AAD-Patienten festgestellt. Da wir eine fast vierfache Anzahl von Patienten untersuchten (93 vs. 24), könnten die Unterschiede zwischen unseren Ergebnissen und denen von Danna et al. auf die größere Stichprobengröße in unserer Studie zurückzuführen sein

Um den Einfluss von Durchfall auf die intestinale Candida-Zahl zu beurteilen, untersuchten wir auch Patienten, die keine Antibiotikatherapie erhielten, aber Durchfall hatten (Gruppe A-D+). In dieser Gruppe war eine Candida-Überwucherung (⩾105 cfu/ml Stuhl) deutlich seltener als bei AAD-Patienten, aber die Candida-Positivität unterschied sich nicht signifikant. Frühere Studien zeigten, dass die normale Stuhlflora bei AAD-Patienten deutlich reduziert war. In Studien, in denen die Auswirkungen von Breitbandantibiotika auf die Zusammensetzung der Darmmikroflora des Menschen untersucht wurden, wurde eine signifikante inverse Korrelation zwischen dem logarithmischen Wert der maximalen Zunahme von Hefen und dem logarithmischen Wert der maximalen Abnahme von Anaerobiern beobachtet. Da wir bei AAD-Patienten, A+D-Patienten und A-D+-Patienten eine erhöhte Candida-Positivität feststellten, vermuten wir, dass die Abnahme der Bakterien im Stuhl, die entweder auf eine Antibiotikatherapie oder auf eine Verdünnung bei Durchfall zurückzuführen ist, die Ausbreitung von Candida-Spezies ermöglichte, was zu einer erhöhten Candida-Positivitätszahl führte

In unserer Studie korrelierten die mittleren Hefezahlen auf mit Gram gefärbten Abstrichen nicht mit den Candida-Kulturen, wenn sie entweder mit der Gesamthefezahl auf Objektträgerausstrichen (r=.27) oder mit dem von Danna et al. vorgeschlagenen Index (r=.12). Über die Diskrepanz zwischen der großen Zahl der unter dem Lichtmikroskop gezählten hefeartigen Zellen und dem geringen oder fehlenden Wachstum von Candida-Arten wurde bereits an anderer Stelle berichtet 15]. In dieser Studie gingen die Autoren davon aus, dass eine große Mehrheit der unter dem Mikroskop nachgewiesenen Hefen im Stuhl nicht lebendig war. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass bei der Interpretation von Stuhlproben von Patienten mit AAD, die positiv für Candida-Spezies sind, große Vorsicht geboten ist. Die Nützlichkeit der Analyse von Stuhlproben auf Candida-Zahlen durch Kultur oder Objektträgerabstriche wird bei diesen Patienten ernsthaft in Frage gestellt. Das Fehlen von Leukozyten in den mit Gram-Färbung gefärbten Proben stimmte mit früheren Ergebnissen überein. Unsere Ergebnisse bestätigten auch, dass Candida-Spezies Teil der normalen Darmflora waren

Aktive Sekretion durch ein Pilztoxin oder toxinähnliche Substanzen wurde als Mechanismus für Candida-bedingte AAD diskutiert. Da SAPs die wichtigsten Virulenzfaktoren bei Candida-Infektionen sind, haben wir diese Proteinasen in vitro untersucht. Bislang wurden 10 verschiedene SAP-Gene in C. albicans identifiziert. Da Sap in einem Modell der oralen Candidose beim Menschen zu Gewebeschäden beiträgt, könnten diese Proteinasen auch Darmepithelzellen schädigen. Bei 8 Patienten mit Verdacht auf Candida-bedingte AAD gab es jedoch keine Anzeichen für eine Colitis oder Zellschäden

In unserer Studie produzierten alle untersuchten C. albicans-Stämme Sap, und es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen der Menge an Sap, die in Candida-Isolaten von AAD-Patienten und Kontrollpersonen produziert wurde. Bei Kindern mit akuter und chronischer Diarrhöe wurden höhere Werte an sekretorischen Candida-Säureproteinasen festgestellt als bei gesunden Kontrollpersonen. Obwohl die für die gesamte Gruppe der Kinder mit akuter oder chronischer Diarrhöe berechneten Sap-Werte signifikant höher waren als die Werte bei den Kontrollpersonen, war dies in einzelnen Fällen nicht der Fall. Von 9 Candida-Isolaten hatten 4 von Kontrollpersonen (Kinder ohne Durchfall) Sap-Werte, die mit denen von Kindern mit chronischem Durchfall vergleichbar waren, und 2 von 9 Kontrollpersonen hatten Werte, die mit denen von Kindern mit akutem Durchfall vergleichbar waren. Trotz dieser hohen Sap-Werte hatten die Kontrollpersonen keinen Durchfall. Dies steht im Gegensatz zu den Ergebnissen früherer Studien, in denen die Sap-Produktion bei symptomatischen Patienten stets höhere Werte erreichte als bei den Kontrollpersonen: Die Sap-Produktion von Candida-Spezies aus Vaginitis-Patienten überstieg stets die Sap-Produktion von Candida-Trägern, und Candida-Stämme aus oraler Candidose bei AIDS-Patienten produzierten ∼8-mal mehr Sap als Isolate von Kontrollpersonen

Die Sap-Produktion wird durch den BSA-Agar-Test und ELISA kohärent angezeigt. Darüber hinaus korrelierten hohe Konzentrationen von in vitro sezerniertem Sap, die mit BSA-Agar oder ELISA nachgewiesen wurden, mit erhöhten Sap-Konzentrationen in vivo (z. B. in Vaginalflüssigkeiten von HIV-positiven Vaginitis-Patienten). Es kann vermutet werden, dass Candida species vorübergehend hohe Mengen an Sap in vivo produziert, diese Fähigkeit aber z. B. durch Subkultivierung verliert. Bei C. albicans, das aus Mundhöhlen isoliert wurde, wurde gezeigt, dass die erhöhte Sap-Produktion ein stabiles Merkmal ist. Andererseits zeigten C. albicans-Isolate mit geringer Proteinase-Produktion eine stabile, geringe Sap-Produktion bei wiederholter Subkultur

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse unserer Studie die zuvor vorgeschlagenen pathogenetischen Mechanismen der Candida-bedingten AAD nicht bestätigen. Unsere Daten deuten darauf hin, dass erhöhte Candida-Zahlen eher eine Folge der Antibiotikabehandlung oder der Diarrhöe an sich sind als eine Ursache der AAD. Die Produktion des wichtigsten Pilzvirulenzfaktors Sap unterschied sich bei Patienten mit AAD nicht von derjenigen der Kontrollpersonen, was darauf hindeutet, dass dieses Pilztoxin nicht für AAD bei Erwachsenen verantwortlich sein könnte. Andere Pilzvirulenzfaktoren (z. B. phospholipases) warrant further investigation