Zellbiologie@Yale

Inhalt der Vorlesung

Membrangebundene Organellen

Eukaryotische Zellen enthalten Ansammlungen von Proteinen, die als eine Einheit funktionieren, die Organellen genannt werden. Einige dieser Organellen sind von einer Membran umgeben, die in ihrer Struktur der Zellmembran ähnelt, aber eine andere Zusammensetzung von Proteinen und Phospholipiden aufweist.

Membrangebundene Organellen bieten eukaryontischen Zellen mehrere Vorteile. Erstens können Zellen Enzyme und Reaktanten in einem kleineren Volumen konzentrieren und isolieren, wodurch sich die Geschwindigkeit und Effizienz chemischer Reaktionen erhöht. Zweitens können Zellen potenziell schädliche Proteine und Moleküle in membrangebundenen Organellen einschließen und so den Rest der Zelle vor ihren schädlichen Auswirkungen schützen. So enthält beispielsweise das Lysosom, eine membrangebundene Organelle, viele Enzyme, die Proteine, Nukleinsäuren und Lipide verdauen. Würden diese Enzyme in das Zytosol freigesetzt, könnten sie die Proteine, Nukleinsäuren und Lipide der Zelle auffressen, was zum Zelltod führen würde. Die Membran, die das Lysosom umgibt, hält diese Verdauungsenzyme vom Rest der Zelle fern.

Mikrotubuli-Organisation des Zytoplasmas

Organellen und Proteine sind in der Regel nicht wahllos in der Zelle verteilt, sondern werden organisiert, indem sie an den Stellen lokalisiert werden, an denen sie benötigt werden. Die Zelle nutzt Mikrotubuli und Motorproteine, um die Organellen zu lokalisieren. Mikrotubuli sind lange Filamente, die sich durch das Zytoplasma ziehen. Zwei Arten von Motorproteinen, Kinesine und Dyneine, laufen entlang der Mikrotubuli und erzeugen Kraft, um Organellen durch das Zytoplasma zu ziehen.

Mikrotubuli sind Polymere eines Heterodimers aus Alpha- und Beta-Tubullin. Tubulin polymerisiert zu linearen Protofilamenten, und ein Mikrotubulus enthält 13 Protofilamente, die in einem Zylinder mit einem hohlen Kern angeordnet sind. Mikrotubuli sind in ein Minus-Ende und ein Plus-Ende polarisiert. Mikrotubuli wachsen von ihrem Plus-Ende aus, indem sie weitere Tubulin-Untereinheiten hinzufügen. Die Minus-Enden der Mikrotubuli sind instabil und werden durch Proteine im Microtubule Organizing Center (MTOC) stabilisiert. Befindet sich das MTOC im Zentrum einer Zelle, strahlen die Mikrotubuli mit ihren Plus-Enden nach außen in Richtung der Plasmamembran aus

Kinesine und Dyneine bewegen sich entlang der Mikrotubuli, indem sie die Energie der ATP-Hydrolyse nutzen. Beide Proteingruppen enthalten motorische Domänen, die Mikrotubuli binden und ATP hydrolysieren. Die Motordomänen erzeugen die Bewegung entlang der Mikrotubuli. Die meisten Kinesine bewegen sich in Richtung des Plus-Endes der Mikrotubuli, während Dynein sich in Richtung des Minus-Endes bewegt. Damit haben die Zellen zwei Möglichkeiten, die Verteilung der Organellen entlang der Mikrotubuli zu steuern. Kinesine und Dyneine enthalten auch eine frachtbindende Domäne, die sie an verschiedene Organellen bindet. Kinesine sind eine große Familie von Proteinen, und die Frachtbindungsdomäne ist die am stärksten divergierende, so dass verschiedene Mitglieder der Kinesin-Familie unterschiedliche Organellen binden können. Dynein ist ein großer Komplex aus mehreren Proteinen, und es ist weniger klar, wie es die Ladung bindet.

Actinfilamente unterstützen ebenfalls den Transport von Zellmaterial, allerdings über viel kürzere Strecken als Mikrotubuli. Aktinfilamente sind ein Polymer aus Aktin, einem kleinen kugelförmigen Protein. Das Aktinfilament ist eine schraubenförmige Anordnung von Aktin und hat, ähnlich wie die Mikrotubuli, ein Plus- und ein Minus-Ende, wobei die Filamente eher an ihren Plus-Enden wachsen. Aktinfilamente verfügen nicht über die ausgedehnten seitlichen Kontakte von Mikrotubuli und sind in der Regel viel kürzer als Mikrotubuli. Aktinfilamente sind in der Regel in der Nähe der Zellmembran lokalisiert, wo sie strukturelle Unterstützung bieten.

Myosine sind eine Klasse von Motorproteinen, die entlang von Aktinfilamenten Kraft erzeugen können. Einige Myosine sind an der Zellkontraktion beteiligt (z. B. Muskelkontraktion), während andere die Bewegung und Positionierung von Organellen unterstützen. Myosine der Klasse V sind am Transport von Organellen in verschiedenen Zelltypen beteiligt. Ähnlich wie die Struktur von Kinesin enthalten die Myosine der Klasse V eine motorische Domäne, die an Aktinfilamente bindet und die Energie der ATP-Hydrolyse nutzt, um sich entlang der Filamente zu bewegen. Der C-Terminus von Myosin V bindet Organellen.

Zum Transport und zur Positionierung von Organellen verwenden Zellen häufig sowohl Mikrotubuli als auch Aktinfilamente. Mikrotubuli, Kinesine und Dyneine werden verwendet, um Organellen über lange Distanzen (mehrere Mikrometer oder mehr) zu bewegen, während Aktinfilamente Organellen über kurze Distanzen (z.B. in der Nähe der Plasmamembran) transportieren. Oft enthält eine Organelle mehr als eine Art von Motorprotein (z. B. Kinesin und Myosin V), damit die Zellen beide Arten von Filamenten zur Positionierung der Organelle nutzen können.

Signalsequenzen

Um die Identität und Funktion der verschiedenen Organellen und der Plasmamembran aufrechtzuerhalten, müssen die Zellen spezifische Proteine auf die Organellen und andere intrazelluläre Kompartimente ausrichten. Die meisten dieser Proteine enthalten eine kurze Sequenz, eine so genannte Signalsequenz, die ihren intrazellulären Standort bestimmt. Signalsequenzen können überall in einem Protein lokalisiert sein, befinden sich jedoch häufig am N-Terminus. Signalsequenzen, die Proteine auf dieselbe Organelle ausrichten, haben oft nicht dieselbe Primärsequenz. In der Regel sind es die allgemeinen biochemischen Eigenschaften der Sequenz, die darüber entscheiden, ob sie ein Protein auf eine Organelle ausrichtet. Signalsequenzen werden verwendet, um sowohl lösliche Proteine als auch integrale Membranproteine zu importieren.

Import von Proteinen in membrangebundene Organellen

Da die Membranen, die die Organellen umgeben, den Durchgang von Proteinen einschränken, haben die Organellen verschiedene Mechanismen für den Import von Proteinen aus dem Zytoplasma entwickelt. Die meisten Organellen enthalten eine Reihe von Membranproteinen, die eine Pore bilden. Diese Pore ermöglicht den Durchgang von Proteinen mit der richtigen Signalsequenz. Einige Poren (ER, Mitochondrien) können nur ungefaltete Proteine aufnehmen, während andere Poren (Kern, Peroxisom) gefaltete Proteine passieren lassen.

Targeting Proteins to the Endoplasmic Reticulum

Proteine, die für die Sekretion, die Plasmamembran oder ein anderes Organell des sekretorischen Weges bestimmt sind, werden zunächst in das ER eingefügt. Die meisten Proteine durchqueren das ER kotranslational, indem sie von Ribosomen im ER synthetisiert werden. Sowohl lösliche Proteine (Proteine, die sich im Lumen von Organellen befinden oder sezerniert werden) als auch integrale Membranproteine werden in das ER eingeschleust und durch denselben Mechanismus transloziert.

Die Signalsequenz für ER-Proteine befindet sich normalerweise am N-Terminus. Das Signalerkennungspartikel (SRP), ein Komplex aus 6 Proteinen und einer RNA, bindet die Signalsequenz unmittelbar nach ihrer Übersetzung. Das SRP interagiert auch mit dem Ribosom und stoppt die Translation. Die Oberfläche der ER-Membranen enthält einen Rezeptor für SRP. Der SRP-Rezeptor rekrutiert SRP, das naszierende ER-Protein und das Ribosom in das ER. Der SRP-Rezeptor löst das SRP von der Signalsequenz und ermöglicht die Fortsetzung der Translation auf der ER-Membran.

Ribosomen auf der ER-Membran binden an den Protein-Translokator. Der Translokator ist ein Transmembranprotein, das eine wässrige Pore bildet. Die Pore ist der Kanal, durch den die neu synthetisierten ER-Proteine durch die ER-Membran transloziert werden. Die Translation des ER-Proteins erzeugt die „Kraft“, um das ER-Protein durch den Kanal zu schieben.

Lösliche Proteine werden vollständig durch den Kanal transloziert; die Signalsequenz verbleibt im Kanal und wird von einer Protease im Lumen des ER vom Rest des Proteins abgespalten.

Integrale Membranproteine enthalten eine Stop-Transfer-Sequenz stromabwärts der Signalsequenz. Die Stopp-Transfersequenz unterbricht die Translokation durch den Kanal und der Teil des Proteins nach der Stopp-Transfersequenz befindet sich außerhalb des ER. Integrale Membranproteine können so transloziert werden, dass sich entweder ihr N-Terminus oder ihr C-Terminus im Lumen des ER befindet. Proteine, deren C-Terminus sich im Lumen befindet, haben meist eine interne Signalsequenz. Der Translokator scheint sich auf einer Seite zu öffnen, damit integrale Membranproteine in die umgebende Lipiddoppelschicht diffundieren können.

Einige Proteine überspannen die Membran mehrmals und diese Proteine enthalten nach der Stopp-Transfersequenz eine Start-Transfersequenz, die die Translokation des Proteins durch den Kanal erneut einleitet. Ein Protein mit einer Signalsequenz, einer Stop-Transfer-Sequenz und einer Start-Transfer-Sequenz würde die Membran zweimal überspannen, wobei eine Schleife im Zytosol oder Lumen verbleibt. Um Proteine zu erzeugen, die die Membran mehrmals überspannen, müsste das Protein mehrere abwechselnde Stopp- und Start-Transfer-Sequenzen haben.

Wenn die Proteine in das ER gelangen, falten sie sich in ihre dreidimensionale Struktur. Es gibt mehrere Mechanismen, die die Faltung von Proteinen unterstützen, darunter Chaperone und Glykosylierung. Das ER enthält auch Mechanismen zur Behandlung von Proteinen, deren Faltung fehlschlägt.

Targeting Proteins to Mitochondria

Obwohl Mitochondrien ihr eigenes Genom enthalten, werden die meisten mitochondrialen Proteine von Kerngenen kodiert, was einen Mechanismus zum Targeting und Import dieser Proteine in die Mitochondrien erforderlich macht. Ähnlich wie Proteine, die in das ER importiert werden, enthalten mitochondriale Proteine eine Signalsequenz, die sie in die Mitochondrien bringt. Anders als ER-Proteine werden mitochondriale Proteine posttranslational importiert. Da Proteine entfaltet sein müssen, um durch Kanäle in der Mitochondrienmembran zu wandern, werden mitochondriale Proteine im Zytosol durch Chaperone ungefaltet gehalten.

Der Proteinimport in Mitochondrien ähnelt dem Import in das ER, wird aber durch das Vorhandensein von zwei Membranen um die Mitochondrien herum erschwert. Mitochondrienproteine können sich in der äußeren Membran, der inneren Membran, dem Intermembranraum oder der Matrix (Raum innerhalb der inneren Membran) befinden, so dass Mitochondrien über Translokatoren verfügen, die den Durchgang von Proteinen durch die äußere und die innere Membran ermöglichen. Der TOM-Komplex vermittelt die Passage durch die äußere Membran, während der TIM-Komplex die Passage durch die innere Membran vermittelt.

Translokation von Proteinen in Mitochondrien

Die Signalsequenz, die Proteine in die Matrix bringt, befindet sich normalerweise am N-Terminus. Die Signalsequenz wird von Proteinen im TOM-Komplex erkannt. Der TOM-Komplex leitet die Proteine in den inneren Membranraum weiter, wo der TIM-Komplex in der inneren Membran das Protein in die Matrix weiterleitet. Der TOM- und der TIM-Komplex arbeiten oft zusammen, um ein Protein durch beide Membranen zu transportieren. Die Translokation durch die Mitochondrienmembranen ist energieabhängig. Chaperone in der Matrix helfen, das Protein durch die innere Membran zu ziehen“, und benötigen ATP-Hydrolyse, um zu funktionieren. Die Proteine falten sich innerhalb der Matrix.

Proteine, die für die innere Membran bestimmt sind, verwenden einen ähnlichen Mechanismus wie Matrixproteine, enthalten jedoch eine Stopp-Transfersequenz, die vom TIM-Komplex erkannt wird. Proteine, die für die äußere Membran bestimmt sind, werden durch die äußere Membran in den Intermembranraum transloziert und dann durch den SAM-Translokator in die äußere Membran importiert. Proteine, die für den Intermembranraum bestimmt sind, werden teilweise in die innere Membran eingefügt und dann von einer Protease gespalten und in den inneren Membranraum freigesetzt.

Import und Export von Kernproteinen

Im Gegensatz zum ER und den Mitochondrien importiert der Kern hauptsächlich lösliche Proteine. Darüber hinaus pendeln Proteine häufig zwischen dem Kern und dem Zytoplasma hin und her, und die Zelle nutzt den Import/Export des Kerns, um mehrere wichtige biochemische Prozesse zu regulieren. Der Zellkern ist von zwei Membranen umgeben, und in diese Membranen sind Tausende von Kernporen eingebettet, durch die Proteine und andere Makromoleküle (RNA, Ribsosomen) in den Kern ein- und aus ihm austreten. Die Kernporen werden in den Membranen durch Lamine stabilisiert, ein Zytoskelettnetz, das unter der inneren Kernmembran liegt und die Membran strukturell unterstützt. Die Kernpore schränkt den Durchgang von Material auf der Grundlage der Größe ein: Dinge, die kleiner als ~ 30 kD sind, können ungehindert durch die Pore diffundieren, aber große Moleküle brauchen einen Weg, um hinein und hinaus zu gelangen. Proteine, die in den Kern eindringen, enthalten ein Kernimport-Signal, und solche, die den Kern auch wieder verlassen müssen, enthalten eine Kernexport-Sequenz.

Unterscheidung zwischen Zytoplasma und Nukleoplasma

Um einen gerichteten Transport von Proteinen in den und aus dem Kern zu ermöglichen, müssen Proteine wissen, ob sie sich im Zytoplasma oder im Kern befinden. Um zwischen Kern und Zytoplasma zu unterscheiden, verwenden die Zellen ein kleines GTP-bindendes Protein namens Ran. Wie alle GTP-bindenden Proteine existiert Ran entweder in einem GTP-gebundenen Zustand oder in einem GDP-gebundenen Zustand. Zwei Proteine katalysieren die Umschaltung zwischen diesen Zuständen. Ran-GAP (GTPase-aktivierendes Protein) katalysiert die GTP-Hydrolyse und erzeugt Ran-GDP. Ran-GEF (Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor) katalysiert die Freisetzung von GDP und die erneute Bindung von GTP, wodurch Ran-GTP entsteht. Ran-GAP ist auf der zytoplasmatischen Seite der Kernporen lokalisiert, während Ran-GEF mit Chromatin assoziiert und daher im Kern lokalisiert ist. Infolgedessen ist das meiste Ran im Kern an GTP und das meiste Ran im Zytoplasma an GDP gebunden.

Kernimport

Rezeptoren (Importine) binden Kernimportsequenzen in Proteinen. Importine interagieren auch mit Filamenten, die sich von der zytoplasmatischen Seite der Kernporen erstrecken. Durch einen unbekannten Mechanismus werden Importine, die an ihre Fracht gebunden sind, durch die Kernpore transportiert. Im Inneren der Pore trifft der Importin-Frachtkomplex auf Ran-GTP. Ran-GTP dissoziiert die Importine von der Fracht und setzt die Frachtproteine frei, damit sie ihre Arbeit im Kern verrichten können.

Kernexport

Viele Proteine, die in den Kern gelangen, müssen in das Zytoplasma exportiert werden (z. B. Importine). Diese Proteine enthalten eine Kernexportsequenz, die mit einem Rezeptor namens Exportin interagiert. Ran-GTP bindet an diesen Exportin-Cargo-Komplex und stabilisiert die Interaktion. Der Exportin-Cargo-Ran-GTP-Komplex wandert durch die Pore (Mechanismus unklar), wo er auf der zytoplasmatischen Seite auf Ran-GAP trifft. Ran-GAP wandelt Ran-GTP in Ran-GDP um, wodurch Exportin von seiner Ladung dissoziiert.

Import von Proteinen in Peroxisomen und Zelleweger-Syndrom

Peroxisomen sind kleine Organellen (~ 1 µm Durchmesser), die eine Vielzahl von Funktionen für Zellen erfüllen. Peroxisomen verstoffwechseln schädliche Chemikalien (Phenole, Formaldehyd, Ethanol), verstoffwechseln Fettsäuren und katalysieren einen Schritt in der Synthese von Plasmalogen, einem Lipid, das im Myelin vorkommt.

Proteine, die für Peroxisomen bestimmt sind, enthalten eine Signalsequenz, die von einer Familie von Proteinen, den so genannten Pex-Proteinen, erkannt wird. Einige dieser Pex-Proteine binden an Signalsequenzen, während andere für eine Pore in der Membran von Peroxisomen sorgen, die den Eintritt von Peroxisom-Proteinen ermöglicht.

Zellen, die Mutationen in Pex-Proteinen aufweisen, können keine Proteine in Peroxisomen importieren, so dass diesen Zellen Peroxisomen fehlen. Mutationen in Pex-Proteinen werden mit einer Reihe von Krankheiten in Verbindung gebracht, die als Zelleweger-Syndrom bezeichnet werden. Beim Zelleweger-Syndrom fehlt den Säuglingen der Muskeltonus und oft auch die Fähigkeit zu saugen. Die Säuglinge weisen auch kraniofaziale Anomalien und eine vergrößerte Leber auf. Die Prognose für Säuglinge, die am Zelleweger-Syndrom leiden, ist schlecht, die meisten überleben nicht länger als ein Jahr.

Da Peroxisomen zur Synthese eines Lipids beitragen, das im Myelin vorkommt, weisen Patienten mit Zelleweger-Krankheit häufig eine schlechte Myelinisierung der Neuronen auf. Die Myelinisierung ist entscheidend für die Funktion der Neuronen bei der Weiterleitung von Signalen an Zielzellen.