Aumento a largo plazo de la masa y la fuerza del músculo esquelético mediante la administración de un solo gen inhibidor de la miostatina
Resultados y discusión
La administración de genes mediada por el VAA en el músculo proporciona un sistema para generar altos niveles de proteína en el tejido diana o mediante un producto secretado transportado a sitios remotos a través de la circulación (19). Hemos clonado en el serotipo 1 del AAV los genes conocidos que inhiben la miostatina secretada, incluyendo la proteína sérica asociada al factor de crecimiento y diferenciación-1 (GASP-1) (18), el gen relacionado con la follistatina (FLRG) (17) y la follistatina-344 (FS) (13), que han demostrado una gran capacidad de transducción muscular. Existen dos isoformas de follistatina generadas por splicing alternativo. La variante FS-344 se somete a la escisión del péptido para generar la isoforma FS-315 y la otra variante FS-317 produce la isoforma FS-288 tras la escisión del péptido. Nosotros utilizamos la variante humana FS-344, que genera exclusivamente la isoforma FS-315 circulante en suero y que incluye una región ácida C-terminal (20). Elegimos el FS-344 (FS), porque la otra isoforma FS-317, que carece de la terminación C, muestra una localización preferente en el líquido folicular ovárico y una alta afinidad de unión a los tejidos a través de proteoglicanos de sulfato de heparina, lo que puede afectar a la capacidad reproductiva y unirse a otros sitios fuera del objetivo (21). La FS-288 representa la forma unida a la membrana de la follistatina (22), es un potente supresor de la hormona estimulante del folículo hipofisario (23), se encuentra en el líquido folicular del ovario y en los testículos, y demuestra una alta afinidad por las células de la granulosa del ovario.
Intentamos determinar la eficacia de estas proteínas para aumentar la masa muscular en ratones normales y distróficos. Administramos 1 × 1011 partículas virales AAV1 por animal que codificaban FS, FLRG, GASP-1 o GFP bilateralmente en los músculos del cuádriceps y tibial anterior de ratones C57BL/6 de 4 semanas de edad de tipo salvaje. Todos los animales tratados con los inhibidores de la miostatina demostraron un aumento de la masa corporal con una mejora bruta observable de los músculos cuando se analizaron a los 725 días de edad en comparación con los controles tratados con GFP (Fig. 1 a y b). La evaluación de los pesos musculares individuales mostró un aumento de la masa muscular en todos los animales tratados con inhibidores de miostatina, con el mayor aumento en los animales tratados con FS. El aumento de la masa muscular se encontró en los músculos de las extremidades posteriores inyectadas y en los músculos alejados del lugar de la inyección, como el tríceps. Así pues, estos inhibidores fueron secretados a la circulación desde el lugar de la inyección muscular, aumentando la masa muscular esquelética en lugares remotos (Fig. 1 c). El aumento de la masa muscular se acompañó de una mejora funcional demostrada por un aumento de la fuerza de agarre de las extremidades posteriores (Fig. 1 d). No hubo ningún efecto sobre la masa del corazón o el aspecto histológico de los cardiomiocitos, lo que indica que la inhibición de la miostatina fue selectiva para el tejido muscular esquelético (datos no mostrados). Existe la preocupación de que el SL afecte negativamente a la función gonadal. No encontramos ningún cambio en la capacidad reproductiva de los ratones tratados con nuestro AAV1 portador del transgén FS344 (AAV1-FS, Tabla 1) Además, no encontramos alteraciones histológicas/patológicas en el tejido gonadal de los ratones tratados con FS en comparación con los controles (datos no mostrados).
Las proteínas inhibidoras de la miostatina aumentan la masa muscular y la fuerza en ratones C57BL/6 de tipo salvaje. (a) La masa muscular bruta de las extremidades posteriores aumenta en todos los ratones tratados con proteínas inhibidoras de la miostatina a los 725 días de edad en comparación con los controles inyectados con AAV1-GFP. (b) La masa corporal total aumenta significativamente en los ratones inyectados con AAV1-FS (**, P ≤ 0,01) y con AAV1-GASP-1 (*, P ≤ 0,05) en comparación con los controles de AAV1-GFP a los 725 días de edad (n = 10). (c) La masa de los músculos individuales de las extremidades posteriores y anteriores aumenta en los ratones inyectados con AAV que expresan proteínas inhibidoras de la miostatina (n = 10). *, P ≤ 0.05. (d) La fuerza de agarre del miembro posterior mejora >2 años en todos los ratones tratados, con las mayores diferencias en los animales tratados con AAV1-FS en comparación con los controles con AAV1-GFP (n = 10). Las barras de error representan el error estándar.
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La reproducción fue normal en los animales tratados con AAV1-FS
Dados los efectos robustos de la administración de FS, a continuación probamos el potencial de AAV1-FS administrado postnatalmente en un paradigma clínicamente significativo para aumentar la masa y la fuerza muscular y retrasar el deterioro muscular en el modelo de ratón mdx de distrofia muscular de Duchenne (DMD). La DMD es una enfermedad recesiva ligada al cromosoma X que resulta en el desgaste de los músculos esqueléticos y la función cardíaca, lo que finalmente resulta en la muerte. Recientemente, se investigó la FS en animales mdx que sobreexpresaban un dominio duplicado del gen de la follistatina. Los resultados demostraron un aumento de la masa muscular y una atenuación de la patología, aunque los resultados sólo se documentaron hasta las 15 semanas de edad (24). En nuestros estudios, los animales mdx fueron inyectados bilateralmente en los músculos cuádriceps y tibial anterior con una dosis baja (1 × 1010 partículas virales) o alta (1 × 1011 partículas virales) de AAV1-FS a las 3 semanas de edad y fueron seguidos durante 5 meses antes de la necropsia. Se detectaron mayores niveles de FS circulante en el suero de los animales tratados con dosis bajas y altas, siendo la dosis alta la que expresó los mayores niveles de FS detectados en suero (dosis alta, 15,3 ± 2,1 ng/ml; dosis baja, 6,8 ± 0,4 ng/ml; controles GFP, 0 ± 0,1 ng/ml; n = 8 por grupo; P < 0,01). Demostramos que el AAV1-FS aumentó la masa corporal en comparación con los controles tratados con GFP, con el mayor aumento en el grupo de alta dosis de FS (datos no mostrados). La observación macroscópica de los ratones tratados con AAV1-FS mostró un aumento significativo del tamaño del músculo en comparación con los animales tratados con AAV1-GFP (Fig. 2 a), con el mayor aumento del peso muscular individual en los animales tratados con dosis altas de FS (Fig. 2 b). Los efectos no se limitaron a los músculos inyectados, sino que también se encontraron en lugares alejados de los músculos directamente afectados (Fig. 2 b). El aumento de la masa muscular se tradujo en una mejora dependiente de la dosis de la fuerza muscular en las extremidades posteriores y anteriores de los animales tratados en comparación con los controles tratados con GFP (Fig. 2 c). Los análisis histológicos y morfométricos de los músculos inyectados con AAV1-FS y en sitios remotos demostraron la hipertrofia de las miofibras, apoyando las observaciones gruesas realizadas en el momento de la necropsia (Fig. 3 a-c). Además, no hubo cambios en los tipos de fibras musculares en los animales tratados con AAV-FS; sin embargo, había menos fibras totales por milímetro cuadrado de área en el músculo tibial anterior en los animales tratados con la dosis alta de AAV-FS (Fig. 3 d y e). Sorprendentemente, los ratones tratados con FS demostraron una reducción significativa de la creatina quinasa sérica en comparación con los controles tratados con GFP (Fig. 4 a). Esto es de interés, porque el SL fue protector a pesar de su falta de corrección de la deficiencia de distrofina subyacente. El mecanismo exacto no está claro, pero uno podría especular que el aumento de la fuerza de las fibras individuales las hace menos susceptibles al daño del estrés de las actividades normales. La participación de las células satélite en la inhibición de la miostatina postnatal sigue siendo completamente resuelta; sin embargo, no vimos un cambio estadístico en los marcadores de células satélite del músculo para los animales tratados con FS (datos no mostrados).
La inyección única de AAV1-FS aumenta la masa muscular y la fuerza en ratones mdx jóvenes. (a) La masa muscular bruta de las extremidades posteriores aumenta en los animales mdx inyectados con AAV1-FS a los 180 días de edad en comparación con los controles inyectados con AAV1-GFP. (b) La masa de los músculos individuales de las extremidades posteriores y anteriores aumenta a los 180 días de edad en los ratones inyectados a las 3 semanas de edad con AAV1-FS en comparación con los controles de AAV1-GFP (n = 15). *, P ≤ 0.05. (c) La fuerza de agarre mejora de forma dependiente de la dosis en ratones mdx jóvenes inyectados a las 3 semanas de edad con AAV1-FS seguidos durante 180 días (n = 15). Rojo, dosis alta de AAV1-FS; azul, dosis baja de AAV1-FS; verde, controles de AAV1-GFP. Las barras de error representan los errores estándar.
Los ratones mdx tratados con AAV1-FS a las 3 semanas de edad y seguidos durante 180 días demuestran hipertrofia de miofibras. (a) Tinción H&E del tibial anterior revela hipertrofia de miofibras en el músculo inyectado con AAV1-FS en comparación con el control AAV1-GFP. (Aumento original, ×40.) (b) El diámetro medio de las miofibras oscuras (oxidativas de contracción lenta), intermedias (glucolíticas oxidativas de contracción rápida) y ligeras (glucolíticas de contracción rápida) en el tibial anterior (indicado por la línea sombreada) aumenta significativamente en los ratones inyectados con AAV1-FS en comparación con los controles inyectados con AAV1-GFP. (P < 0,001; n = 5). (c) El diámetro medio de las miofibras intermedias y ligeras (indicadas por la línea sombreada) en el tríceps aumenta significativamente en los ratones inyectados con AAV1-FS en comparación con los controles inyectados con AAV1-GFP. (P < 0,001; n = 5.) (d) La distribución de las fibras oscuras, intermedias y ligeras determinada por la tinción de la deshidrogenasa succínica (SDH) no se modifica por el tratamiento con dosis altas o bajas de AAV1-FS. (P > 0,05 entre todos los grupos; n = 5.) (e) El número medio de fibras contadas por un marco de recuento imparcial de 0,14 mm2 está disminuido en el tibial anterior de los ratones tratados con AAV1-FS, dado que el diámetro medio de las miofibras está aumentado. (*, P < 0,01; n = 5.) Las barras de error representan errores estándar.
Los ratones mdx tratados con AAV1-FS muestran una disminución de los marcadores de daño muscular y los ratones mdx envejecidos responden al tratamiento con FS con beneficio funcional. (a) Los niveles de creatina quinasa en suero (unidades/litro) disminuyen a los 3 meses después de la inyección con AAV1-FS en comparación con los controles inyectados con AAV1-GFP. (*, P < 0,05; n = 10.) Las barras de error representan los errores estándar. (b) La fuerza de agarre de las extremidades posteriores aumenta significativamente (P ≤ 0,05) a los 275 días y más en los ratones mdx envejecidos tratados con AAV1-FS a los 210 días de edad (n = 15). Rojo, dosis altas de AAV1-FS; verde, controles de AAV1-GFP. (c) La tinción H&E del gastrocnemio envejecido demuestra la reducción de la patología cuando se inyecta a los 210 días de edad con FS en comparación con los controles inyectados con GFP. (Aumento original, ×40.) (d) La tinción con H&E del diafragma de los animales inyectados a los 210 días de edad con FS muestra un menor reemplazo de grasa que los controles inyectados con GFP en la fase tardía. (Ampliación original, ×20.)
También evaluamos el potencial de AAV1-FS para aumentar la fuerza muscular en los animales mdx cuando se tratan a una edad más avanzada. Encontramos que la inyección de AAV1-FS a los 210 días de edad aumentó la fuerza muscular ≈60 días después de la administración y que el aumento de la fuerza persistió a largo plazo a lo largo de los 560 días evaluados en este estudio (Fig. 4 b). Ya a los 180 días de edad, antes del tratamiento con AAV1-FS, había una patología evidente en los músculos de los animales mdx no tratados, con una prominente proliferación del tejido conectivo endomisial e inflamación (Fig. 4 c y d). La evaluación patológica de los músculos gastrocnemios y del diafragma a los 560 días de edad demostró que los animales tratados con AAV1-FS tenían sustancialmente menos grupos focales de fibras musculares necróticas e infiltrados de células mononucleares. Es importante destacar que los animales tratados con AAV1-FS tenían áreas focales significativamente reducidas de proliferación de tejido conectivo endomisio, que eran pronunciadas en los animales tratados con GFP, lo que demuestra que la fibrosis, un sello distintivo de la distrofia muscular, se redujo en los animales tratados con FS (Fig. 4 c). La patología en el diafragma también mostró que el tratamiento con FS redujo la inflamación y el reemplazo graso en comparación con los animales tratados con GFP (Fig. 4 d). Además, el tratamiento con AAV1-FS demostró aumentos significativos en los diámetros de las fibras musculares a esta edad en comparación con los animales de control tratados con GFP (Fig. 4 c y d). Estos resultados demostraron que la inhibición de la miostatina mediante el tratamiento con FS fue beneficiosa en animales mdx envejecidos que habían sufrido múltiples rondas de degeneración y regeneración muscular. La traducción a un paralelo clínico sugiere que la terapia génica de FS mediada por AAV podría tener potencial para el paciente anciano con DMD independientemente de reemplazar el gen faltante y puede tener un papel potencial en la terapia combinada similar a la demostrada para el reemplazo génico de IGF-1 y minidistrofina (25).
Estos resultados sugieren que la inhibición de miostatina por FS-344, entregada por una sola inyección de AAV1 puede mejorar el tamaño y la fuerza del músculo y es bien tolerada por >2 años. Los resultados del FS344 pueden ofrecer una estrategia más potente que otras dirigidas únicamente a la miostatina debido a los efectos aditivos, como la participación de la folistatina en múltiples vías de señalización, y al reciente hallazgo que demuestra una reducción de la inflamación en un modelo de endotoxemia (15, 26). La sorprendente capacidad de FS para proporcionar una mejora bruta y funcional a largo plazo a los músculos distróficos en animales de edad justifica su consideración para el desarrollo clínico para tratar las enfermedades musculoesqueléticas, incluyendo a los pacientes de edad avanzada con DMD.