Rollo de Candida en la diarrea asociada a antibióticos
Resumen
Para evaluar cuantitativamente el papel de las especies de Candida en la diarrea asociada a antibióticos (DAA), se cultivaron muestras de heces de un total de 395 pacientes y sujetos de control en un medio de aislamiento diferencial: 98 pacientes tenían DAA, 93 pacientes tomaban antibióticos pero no tenían diarrea (A+D-), 97 pacientes no tomaban antibióticos pero tenían diarrea (A-D+) y 107 pacientes eran sujetos de control (A-D-). Además, se analizó la producción de aspartyl proteinasa secretada (Sap). En los pacientes con DAA, la positividad de Candida (77/98) y el sobrecrecimiento de Candida (62/98) no fueron diferentes de los de los pacientes A+D- (75/93 y 52/93 , respectivamente). El sobrecrecimiento de Candida entre los pacientes A-D+ (40/97, P=.003) fue menos frecuente que entre los pacientes AAD, pero la positividad de Candida no fue diferente (80/97, P=.612). En los sujetos de control, la positividad de Candida y el sobrecrecimiento fueron menos frecuentes que en todos los demás grupos. La producción de savia no difirió entre los pacientes con DAA y los sujetos de control (P=0,568 y P=0,590, respectivamente). Los datos indican que los recuentos elevados de Candida son un resultado del tratamiento antibiótico o de la diarrea más que una causa de la DAA
La candidiasis oral y la esofagitis son las manifestaciones patológicas más comunes de las infecciones por Candida . El papel de Candida en la diarrea asociada a antibióticos (DAA) ha sido debatido . Se ha considerado que las concentraciones fecales de especies de Candida de ⩾105 ufc/mL de heces causan diarrea en los pacientes después de la terapia con antibióticos. Se ha informado de que los pacientes que recibieron antibióticos sin desarrollar diarrea tenían <105 ufc de hongos Candida/mL de heces
Las aspartyl proteinasas segregadas (Saps) son importantes factores de virulencia producidos por las especies de Candida. Las Saps están implicadas en la adherencia de Candida albicans a la mucosa humana y en la invasión del tejido humano. Se ha demostrado una correlación entre la expresión de Saps y la virulencia de Candida en la candidiasis oral y la vaginitis por Candida en pacientes infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). En la DAA relacionada con Candida, se ha discutido la secreción activa mediada por una toxina fúngica o sustancias similares a la toxina como mecanismo patogénico de la diarrea . En C. albicans se han identificado 10 genes SAP diferentes. En Candida tropicalis se ha observado una débil actividad proteolítica extracelular, mientras que Candida glabrata no tiene actividad proteolítica en agar proteico
Se sabe que C. albicans produce aspartyl proteinasas cuando se cultiva en medio con proteína como única fuente de nitrógeno , y la expresión del gen SAP2 es la principal responsable de la actividad proteolítica observada en la mayoría de las cepas que crecen en forma de levadura in vitro . Las savias también muestran actividad proteolítica en el tracto gastrointestinal; se ha demostrado la expresión de SAP en la candidiasis oral y la degradación de la mucina gastrointestinal por parte de las savias . La degradación de la mucina gastrointestinal por medio de enzimas ha sido implicada como un determinante de virulencia para una serie de enteropatógenos (por ejemplo, Vibrio cholerae, especies de Shigella, Helicobacter pylori y Yersinia enterocolitica) . En el caso de C. albicans, que coloniza las superficies de las mucosas, la degradación de la mucina por SAP2 puede permitir una mayor aproximación a las células epiteliales y/o la modificación de las superficies celulares . Se encontraron niveles más altos de proteinasa ácida secretora de Candida en niños con diarrea aguda y crónica que en sujetos de control sanos
Para dilucidar la relevancia patogenética de las especies de Candida en pacientes adultos con DAA, realizamos cultivos fecales cuantitativos para especies de Candida en 395 adultos inmunocompetentes. Además, se examinó la producción de Saps
Métodos
Selección de pacientes y recogida de muestras de hecesTodos los pacientes de un departamento médico de 250 camas fueron encuestados por diarrea o por tratamiento antibiótico en ausencia de diarrea diariamente durante 11 meses. La diarrea se definió como >3 deposiciones blandas o acuosas al día . El tratamiento antibiótico se definió como la recepción de antibióticos orales o intravenosos en dosis terapéuticas durante ⩾1 día. La DAA se definió como >3 deposiciones blandas o acuosas al día durante o hasta 2 meses después del tratamiento antibiótico . Los pacientes fueron reclutados consecutivamente en 4 grupos de estudio hasta alcanzar los números predeterminados necesarios para la comparación estadística (véase el análisis estadístico más adelante). Los pacientes se incluyeron una sola vez durante su ingreso en el hospital
Las muestras de heces de todos los pacientes con diarrea se cultivaron para detectar patógenos bacterianos (salmonella, shigella, yersinia y campylobacter) en agar selectivo, se examinaron para detectar óvulos y parásitos, y se analizaron para detectar Clostridium difficile mediante cultivo en agar selectivo y mediante el uso de la prueba rápida de C. difficile (BD). Los pacientes con alguno de estos patógenos fueron excluidos del estudio. Así, se incluyeron en el estudio 395 pacientes (195 con diarrea y 200 sin ella), que fueron asignados a 4 grupos (1) grupo A+D+, 98 pacientes con DAA que recibían antibióticos y experimentaban diarrea; (2) grupo A+D-, 93 pacientes que recibían antibióticos pero no experimentaban diarrea; (3) grupo A-D+, 97 pacientes que no recibían antibióticos pero experimentaban diarrea; y (4) grupo A-D-, 107 sujetos de control que no recibían antibióticos y no experimentaban diarrea
Los 4 grupos no diferían en la distribución de sexo y edad. Las muestras de heces de todos los sujetos se recogieron inmediatamente después de la defecación y se llevaron al laboratorio en el mismo edificio en un plazo de 15 minutos. Las muestras de heces expulsadas durante la noche se almacenaron a 4°C y se procesaron a la mañana siguiente
Cultivos de cándida y frotis en portaobjetosLas muestras de heces se diluyeron 1:10 con solución salina, se agitaron en un homogeneizador de heces y se volvieron a diluir 1:1000 y 1:10000 con solución salina. Se transfirieron cien microlitros de cada dilución a un CHROMagar de Candida (BBL) y se sembraron uniformemente con un hisopo estéril. Tras la incubación a 37°C durante 48 h en aire ambiente, se contaron las colonias de Candida y se clasificaron como C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis u otras especies de Candida, según el color de las colonias. Un recuento de colonias ⩾105 ufc/mL de heces se clasificó como «sobrecrecimiento de Candida», según Danna et al. Un frotis en portaobjetos de cada dilución de las primeras 100 muestras de heces consecutivas se tiñó con la tinción de Gram y se examinó mediante microscopía óptica para detectar la presencia de levaduras y leucocitos
Detección de saviaLos aislados de Candida consecutivos de los grupos de pacientes A-D- y A+D+ se sometieron a pruebas de secreción de aspartilproteínas en agar albúmina de suero bovino (BSA) (1,17% de base de carbono de levadura , 0,01% de extracto de levadura y 0,2% de BSA ), como se describe en otro lugar . El medio se ajustó a pH 5,0, se esterilizó por filtración (tamaño de poro, 0,2 μm), y se añadió a una solución madre de agar autoclavado (2%). La proteólisis, que indica la actividad enzimática, se midió en milímetros y se puntuó como se sugiere en otro lugar : – o ± (no había clarificación visible o muy limitada del agar alrededor de la colonia), 1+ (se observaba una proteólisis apreciable) y 2+ (la clarificación del agar superaba ampliamente el margen de la colonia). Se investigaron como controles la cepa SC5314 de C. albicans y un mutante nulo de SAP2 (proporcionado por B. Hube, Universidad de Hamburgo, Alemania)
Análisis estadísticoSe comparó el número de pacientes con diferentes recuentos de Candida en diferentes grupos mediante el uso de la prueba de χ2, y se correlacionaron los recuentos de levaduras en frotis de portaobjetos con los recuentos de Candida de los cultivos mediante el uso de la correlación de Pearson. Las diferencias en la producción de savia se calcularon mediante las pruebas t de Student y exacta de Fisher. El tamaño de la muestra para la prueba de cultivos se calculó en 91 pacientes evaluables, y para la prueba de Sap, se calculó en 20 pacientes evaluables por grupo, con un α de 0,05 y una potencia de 0,8 (SigmaStat, versión 2.0; Jandel Scientific). Las diferencias con P<.05 se consideraron significativas
Resultados
Cultivos de Candida y frotis de portaobjetosLos resultados de los cultivos de Candida se muestran en la figura 1. En el grupo A+D+, la positividad de Candida (en 77/98 pacientes) y el sobrecrecimiento de Candida (en 62/98 pacientes) no fueron significativamente diferentes de los del grupo A+D- (75/93 pacientes y 52/93 pacientes , respectivamente). En el grupo A-D+, el sobrecrecimiento de Candida fue significativamente menos frecuente que en el grupo A+D+ (P=.003), pero la positividad de Candida no fue significativamente diferente (P=.612). La positividad y el sobrecrecimiento de Candida fueron significativamente menos frecuentes en el grupo A-D- que en todos los demás grupos (positividad de Candida: 66/107 pacientes, P=.013, en comparación con el grupo A+D+; P=.005, en comparación con el grupo A+D-; y P=.002, en comparación con el grupo A-D+; sobrecrecimiento de Candida: 15/107 pacientes, P<.001, en comparación con todos los demás grupos; figura 1)
Resultados de los recuentos de Candida en las muestras de heces de los diferentes grupos del estudio: grupo A+D+, pacientes con diarrea asociada a antibióticos que recibían antibióticos y experimentaban diarrea; grupo A+D-, pacientes que recibían antibióticos pero no experimentaban diarrea; grupo A-D+, pacientes que no recibían antibióticos pero experimentaban diarrea; y grupo A-D-, pacientes de control que no recibían antibióticos y no experimentaban diarrea. Las barras del histograma (eje Y izquierdo) muestran los resultados de los cultivos negativos (blanco) y los cultivos con especies de Candida, a niveles ⩾105 ufc/mL de heces (negro) y <105 ufc/mL de heces (gris). Los gráficos de puntos (eje Y derecho) junto a cada una de las barras del histograma muestran la distribución de la frecuencia de ufc/mL
Resultados de los recuentos de Candida en las muestras de heces de los diferentes grupos de estudio: grupo A+D+, pacientes con diarrea asociada a antibióticos que recibían antibióticos y experimentaban diarrea; grupo A+D-, pacientes que recibían antibióticos pero no experimentaban diarrea; grupo A-D+, pacientes que no recibían antibióticos pero experimentaban diarrea; y grupo A-D-, pacientes de control que no recibían antibióticos y no experimentaban diarrea. Las barras del histograma (eje Y izquierdo) muestran los resultados de los cultivos negativos (blanco) y los cultivos con especies de Candida, a niveles ⩾105 ufc/mL de heces (negro) y <105 ufc/mL de heces (gris). Los gráficos de puntos (eje Y derecho) junto a cada una de las barras del histograma muestran la distribución de la frecuencia de ufc/mL
Los análisis exploratorios utilizando diferentes puntos de corte para la definición del sobrecrecimiento de Candida (103, 104, 106 o 107 ufc/mL de heces) arrojaron resultados cualitativamente similares. En todos los cálculos, el sobrecrecimiento de Candida fue significativamente menos frecuente en el grupo A-D- que en todos los demás grupos. C. albicans fue el aislado más frecuente (216 de 395 pacientes), seguido de C. glabrata (104 de 395 pacientes), C. tropicalis (21 de 395 pacientes), C. krusei (11 de 395 pacientes) y otras especies de Candida (97 de 395 pacientes). Se encontraron cultivos mixtos de Candida en 122 (31%) de 395 pacientes. Los recuentos de levaduras en los frotis de portaobjetos no se correlacionaron con los recuentos de los cultivos (r=.27; figura 2)
Correlación de los recuentos de levaduras en los frotis de portaobjetos y los cultivos de Candida (r=.27, correlación de Pearson)
Correlación de los recuentos de levaduras en los frotis de los portaobjetos y en los cultivos de Candida (r=.27, correlación de Pearson)
Resultados de la actividad proteolítica en agar BSAEn general, se probó la actividad proteolítica en agar BSA de 23 aislados A+D+ y 20 A-D-Candida. La media±SD de la actividad fue de 1,26±1,06 mm para el grupo A+D+ y de 1,42±0,64 mm para el grupo A-D-. De los 23 aislados A+D+, 16 tuvieron una puntuación de proteólisis de 1+ (zona de clarificación de 1-2 mm) y 1 tuvo una puntuación de 2+ (zona de clarificación de 3-5 mm), indicando ambas la presencia de actividad enzimática de proteinasa. De los 20 aislados A-D-, 17 tenían una puntuación de proteólisis de 1+ y 2 tenían una puntuación de 2+. Todos los aislados de C. albicans mostraron zonas de clarificación en el medio BSA (⩾1 mm, puntuación ⩾1+). En el grupo A-D-, 1 aislado de C. tropicalis no mostró proteólisis. En el grupo A+D+, 5 aislados de C. glabrata y 1 aislado de C. tropicalis no mostraron proteólisis. Las zonas de clarificación del grupo A-D- y A+D+ no fueron significativamente diferentes cuando se midieron en milímetros (P=0,568, prueba t de Student) o con el sistema de puntuación 1+/2+ (P=0,294 y P=0,590 para los aislados con puntuación 1+ y 2+, respectivamente, prueba exacta de Fisher). Cuando se eliminaron los aislados de C. glabrata (que se sabe que son negativos en agar proteína), no hubo diferencias significativas en la producción de Sap entre los grupos (P=.347)
Discusión
Se ha postulado que el sobrecrecimiento de Candida causa DAA . Se investigó la presencia y la cantidad de especies de Candida en pacientes con sospecha de padecer DAA, pacientes sin diarrea pero que tomaban antibióticos, pacientes con diarrea pero que no tomaban antibióticos y pacientes sin diarrea y que no tomaban antibióticos (sujetos de control). Una proporción significativamente mayor de muestras de heces de pacientes que recibían terapia antimicrobiana y experimentaban diarrea (grupo A+D+) eran positivas para especies de Candida y tenían recuentos de colonias más altos que las muestras de los sujetos de control (grupo A-D-). En un estudio de Danna et al. se observó un sobrecrecimiento de Candida (⩾105 ufc/mL de heces) en 7 (29%) de 24 pacientes con DAA. En ese estudio, 0 de 24 pacientes sin diarrea pero que recibían antibióticos tenían sobrecrecimiento de Candida . Sin embargo, en nuestro estudio, 52 (56%) de 93 pacientes con antibióticos pero sin diarrea tenían sobrecrecimiento de Candida, y no se observaron diferencias, en comparación con los pacientes con DAA. Dado que investigamos un número casi 4 veces mayor de pacientes (93 frente a 24), las diferencias entre nuestros hallazgos y los de Danna et al. pueden deberse al mayor tamaño de la muestra en nuestro estudio
Para evaluar la influencia de la diarrea en los recuentos intestinales de Candida, también investigamos a los pacientes que no recibían terapia antibiótica pero que tenían diarrea (grupo A-D+). En este grupo, el sobrecrecimiento de Candida (⩾105 ufc/mL de heces) fue significativamente menos frecuente que en los pacientes con DAA, pero la positividad de Candida no fue significativamente diferente. Estudios anteriores demostraron que la flora fecal normal estaba notablemente disminuida en los pacientes con DAA. En estudios en los que se investigaron los efectos de los antibióticos de amplio espectro en la composición de la microflora intestinal de los seres humanos, se observó una correlación inversa significativa entre el logaritmo del aumento máximo de levaduras y el logaritmo de la disminución máxima de anaerobios . Dado que encontramos un aumento de la positividad de Candida en los pacientes AAD, A+D- y A-D+, sugerimos que la disminución de las bacterias en las heces, debida a la terapia con antibióticos o a la dilución en la diarrea, permitió que las especies de Candida se expandieran, dando lugar a un aumento de los recuentos de positividad de Candida
En nuestro estudio, los recuentos medios de levaduras en los frotis teñidos con la tinción de Gram no se correlacionaron con los cultivos de Candida cuando se calcularon con el número total de levaduras en los frotis de los portaobjetos (r=.27) o con el índice sugerido por Danna et al. (r=.12). La discrepancia entre el gran número de células parecidas a las levaduras contadas al microscopio óptico y el escaso o nulo crecimiento de las especies de Candida se ha comunicado en otro lugar 15]. En ese estudio, los autores supusieron que una gran mayoría de las levaduras en las heces detectadas al microscopio no estaban vivas . Nuestros resultados indicaron que hay que tener mucha precaución a la hora de interpretar las muestras de heces de los pacientes con DAA y positivas para especies de Candida. La utilidad de analizar las heces para el recuento de Candida mediante cultivo o frotis en portaobjetos en estos pacientes está seriamente cuestionada. La ausencia de leucocitos en las muestras teñidas con la tinción de Gram fue coherente con los hallazgos anteriores . Nuestros resultados también confirmaron que las especies de Candida formaban parte de la flora intestinal normal
Se ha discutido la secreción activa mediada por una toxina fúngica o sustancias similares a la toxina como mecanismo para la DAA relacionada con Candida . Dado que las SAP son los principales factores de virulencia en las infecciones por Candida , investigamos estas proteinasas in vitro. Hasta la fecha, se han identificado 10 genes SAP diferentes en C. albicans . Dado que se ha informado de que las SAP contribuyen al daño tisular en un modelo de candidosis oral humana , estas proteinasas también pueden dañar las células epiteliales intestinales. Pero en 8 pacientes con sospecha de padecer DAA relacionada con Candida, no hubo evidencia de colitis o daño celular
En nuestro estudio, todas las cepas de C. albicans investigadas produjeron Sap, y no hubo diferencias significativas entre la cantidad de Sap producida en los aislados de Candida de pacientes con DAA y los sujetos de control. Se encontraron mayores niveles de proteinasas ácidas secretoras de Candida en los niños con diarrea aguda y crónica que en los sujetos de control sanos . Aunque los niveles de Sap calculados para todo el grupo de niños con diarrea aguda o crónica fueron significativamente más altos que los niveles en los sujetos de control, no fue así en los casos individuales. De los 9 aislados de Candida, 4 de los sujetos de control (niños sin diarrea) tenían niveles de Sap comparables a los de los niños con diarrea crónica, y 2 de los 9 sujetos de control tenían niveles comparables a los de los niños con diarrea aguda. A pesar de estos altos niveles de Sap, los sujetos de control no tenían diarrea. Esto contrasta con los hallazgos de estudios anteriores, en los que la producción de Sap en los pacientes sintomáticos siempre alcanzó niveles más altos que en los sujetos de control: La producción de Sap por parte de las especies de Candida procedentes de pacientes con vaginitis siempre superaba la producción de Sap por parte de Candida de los portadores, y las cepas de Candida procedentes de la candidiasis oral en pacientes con SIDA producían ∼8 veces más Sap que los aislados de los sujetos de control
La producción de Sap está indicada de forma coherente por la prueba de agar BSA y ELISA . Además, los altos niveles de Sap secretados in vitro y detectados por el agar BSA o el ELISA se correlacionaron con el aumento de los niveles de Sap in vivo (por ejemplo, en los fluidos vaginales de pacientes con vaginitis positiva al VIH) . Se puede especular que las especies de Candida producen temporalmente altos niveles de Sap in vivo, pero pierden esta capacidad debido, por ejemplo, al subcultivo. En C. albicans aislada de cavidades orales, se demostró que la producción elevada de Sap era una característica estable. Por otro lado, los aislados de C. albicans con baja producción de proteinasa mostraron una producción de Sap estable y de bajo nivel en repetidos subcultivos
En resumen, los resultados de nuestro estudio no confirman los mecanismos patogenéticos previamente sugeridos de la DAA relacionada con Candida . Nuestros datos indican que los recuentos elevados de Candida son un resultado del tratamiento con antibióticos o de la diarrea per se más que una causa de la DAA. La producción del principal factor de virulencia fúngica Sap en los pacientes con DAA no difiere de la de los sujetos de control, lo que indica que esta toxina fúngica puede no ser responsable de la DAA en adultos. Otros factores de virulencia fúngica (por ejemplo phospholipases) warrant further investigation
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
.
,
.
,
,
(pg.
–
)
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
Presented in part: Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Toronto, Canada, 2000 (poster category J, no. 221)
This study was approved by the ethics committee of Karl-Franzens University, Graz
Financial support: Österreichische Nationalbank; Austrian Society of Infectious Diseases