Amélioration à long terme de la masse et de la force des muscles squelettiques par l’administration d’un seul gène d’inhibiteurs de la myostatine

Résultats et discussion

L’administration de gènes au muscle par AAV fournit un système permettant de générer des niveaux élevés de protéines dans le tissu cible ou par un produit sécrété transporté vers des sites éloignés par la circulation (19). Nous avons cloné les gènes inhibiteurs de la myostatine sécrétés connus, y compris la protéine sérique associée au facteur de croissance et de différenciation-1 (GASP-1) (18), le gène lié à la follistatine (FLRG) (17) et la follistatine-344 (FS) (13) dans le sérotype 1 d’AAV, qui ont démontré des capacités de transduction musculaire élevées. Il existe deux isoformes de la follistatine générées par épissage alternatif. Le variant FS-344 subit un clivage peptidique pour générer l’isoforme FS-315 et l’autre variant FS-317 produit l’isoforme FS-288 après clivage peptidique. Nous avons utilisé le variant humain FS-344, qui génère exclusivement l’isoforme FS-315 de la FS circulant dans le sérum et comprend une région acide C-terminale (20). Nous avons choisi la FS-344 (FS), car l’autre isoforme FS-317, dépourvue de l’extrémité C-terminale, présente une localisation préférentielle dans le fluide folliculaire ovarien et une forte affinité de liaison tissulaire par l’intermédiaire des protéoglycanes à héparine sulfate, ce qui peut affecter la capacité de reproduction et se lier à d’autres sites hors cible (21). FS-288 représente la forme membranaire de la follistatine (22), est un puissant suppresseur de l’hormone hypophysaire folliculo-stimulante (23), se trouve dans le liquide folliculaire de l’ovaire et dans les testicules, et démontre une haute affinité pour les cellules de la granulosa de l’ovaire.

Nous avons cherché à déterminer l’efficacité de ces protéines pour augmenter la masse musculaire chez les souris normales et dystrophiques. Nous avons administré 1 × 1011 particules virales AAV1 par animal codant pour FS, FLRG, GASP-1 ou GFP de manière bilatérale dans les muscles quadriceps et tibialis anterior de souris C57BL/6 de type sauvage âgées de 4 semaines. Tous les animaux traités avec les inhibiteurs de la myostatine ont montré une augmentation de la masse corporelle avec une augmentation brute observable des muscles lorsqu’ils ont été analysés à l’âge de 725 jours par rapport aux témoins traités avec la GFP (Fig. 1 a et b). L’évaluation du poids des muscles individuels a montré une augmentation de la masse musculaire chez tous les animaux traités par des inhibiteurs de la myostatine, l’augmentation la plus importante étant observée chez les animaux traités par FS. L’augmentation de la masse musculaire a été constatée dans les muscles injectés des membres postérieurs et dans les muscles éloignés du site d’injection, comme le triceps. Ainsi, ces inhibiteurs ont été sécrétés dans la circulation à partir du site d’injection du muscle, augmentant la masse musculaire squelettique dans les sites éloignés (Fig. 1 c). L’augmentation de la masse musculaire s’est accompagnée d’une amélioration fonctionnelle démontrée par une augmentation de la force de préhension des membres postérieurs (Fig. 1 d). Il n’y a pas eu d’effet sur la masse cardiaque ou l’aspect histologique des cardiomyocytes, ce qui indique que l’inhibition de la myostatine était sélective au tissu musculaire squelettique (données non présentées). On s’est inquiété des effets négatifs de la SF sur la fonction gonadique. Nous n’avons trouvé aucun changement dans la capacité de reproduction chez les souris traitées avec notre AAV1 portant le transgène FS344 (AAV1-FS, tableau 1).De plus, nous n’avons trouvé aucune altération histologique/pathologique dans le tissu gonadique des souris traitées par FS par rapport aux contrôles (données non présentées).

Compte tenu des effets robustes de l’administration de FS, nous avons ensuite testé le potentiel de l’AAV1-FS administré postnatalement dans un paradigme cliniquement significatif pour augmenter la masse et la force musculaires et retarder la détérioration musculaire dans le modèle de souris mdx de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). La DMD est une maladie récessive liée au chromosome X qui entraîne la fonte des muscles squelettiques et de la fonction cardiaque, pour finalement aboutir à la mort. Récemment, la FS a été étudiée chez des animaux mdx surexprimant un domaine dupliqué du gène de la follistatine. Les résultats ont démontré une augmentation de la masse musculaire et une pathologie atténuée, bien que les résultats n’aient été documentés que jusqu’à l’âge de 15 semaines (24). Dans nos études, des animaux mdx ont été injectés bilatéralement dans les muscles quadriceps et tibialis anterior avec une dose faible (1 × 1010 particules virales) ou élevée (1 × 1011 particules virales) d’AAV1-FS à l’âge de 3 semaines et suivis pendant 5 mois avant l’autopsie. Des niveaux accrus de FS circulants ont été détectés dans le sérum des animaux traités à faible et à forte dose, la forte dose exprimant les plus grands niveaux de FS détectés dans le sérum (forte dose, 15,3 ± 2,1 ng/ml ; faible dose, 6,8 ± 0,4 ng/ml ; contrôles GFP, 0 ± 0,1 ng/ml ; n = 8 par groupe ; P < 0,01). Nous avons démontré que l’AAV1-FS augmentait la masse corporelle par rapport aux témoins traités par GFP, l’augmentation la plus importante étant observée dans le groupe FS à forte dose (données non présentées). L’observation brute des souris traitées par AAV1-FS a montré une augmentation significative de la taille des muscles par rapport aux animaux traités par AAV1-GFP (Fig. 2 a), avec la plus grande augmentation individuelle du poids des muscles chez les animaux traités par FS à haute dose (Fig. 2 b). Les effets n’étaient pas limités aux muscles injectés ; ils ont également été constatés dans des sites éloignés des muscles directement ciblés (Fig. 2 b). L’augmentation de la masse musculaire s’est traduite par une amélioration dose-dépendante de la force musculaire dans les membres postérieurs et antérieurs des animaux traités par rapport aux témoins traités par GFP (Fig. 2 c). Les analyses histologiques et morphométriques des muscles injectés par l’AAV1-FS et des sites distants ont montré une hypertrophie des myofibres, confirmant les observations macroscopiques faites au moment de la nécropsie (Fig. 3 a-c). En outre, il n’y a pas eu de changement dans les types de fibres musculaires chez les animaux traités par AAV-FS ; cependant, il y avait moins de fibres totales par millimètre carré de surface dans le muscle tibialis anterior chez les animaux traités par la dose élevée d’AAV-FS (Fig. 3 d et e). De manière frappante, les souris traitées par FS ont montré une réduction significative de la créatine kinase sérique par rapport aux contrôles traités par GFP (Fig. 4 a). Ceci est intéressant, car la FS a été protectrice malgré l’absence de correction de la déficience sous-jacente en dystrophine. Le mécanisme exact n’est pas clair, mais on peut supposer que l’augmentation de la force des fibres individuelles les rend moins susceptibles d’être endommagées par le stress des activités normales. L’implication des cellules satellites dans l’inhibition postnatale de la myostatine reste à résoudre complètement ; cependant, nous n’avons pas observé de changement statistique dans les marqueurs de cellules satellites musculaires pour les animaux traités par FS (données non présentées).

Nous avons également évalué le potentiel de l’AAV1-FS à augmenter la force musculaire chez les animaux mdx lorsqu’ils sont traités à un âge plus avancé. Nous avons constaté que l’injection d’AAV1-FS à l’âge de 210 jours augmentait la force musculaire ≈60 jours après l’administration et que l’augmentation de la force persistait à long terme tout au long des 560 jours évalués dans cette étude (Fig. 4 b). Dès l’âge de 180 jours, avant le traitement par AAV1-FS, on observe une pathologie évidente dans les muscles des animaux mdx non traités, avec une prolifération du tissu conjonctif endomysial et une inflammation proéminentes (Fig. 4 c et d). L’évaluation pathologique des muscles du gastrocnémien et du diaphragme à l’âge de 560 jours a montré que les animaux traités par AAV1-FS présentaient beaucoup moins de groupes focaux de fibres musculaires nécrotiques et d’infiltrats de cellules mononucléaires. Il est important de noter que les animaux traités par AAV1-FS présentaient une réduction significative des zones focales de prolifération du tissu conjonctif endomysial, qui étaient prononcées chez les animaux traités par GFP, ce qui démontre que la fibrose, une caractéristique de la dystrophie musculaire, était réduite chez les animaux traités par FS (Fig. 4 c). La pathologie du diaphragme a également montré que le traitement par FS réduisait l’inflammation et le remplacement des graisses par rapport aux animaux traités par GFP (Fig. 4 d). En outre, le traitement par AAV1-FS a montré une augmentation significative du diamètre des fibres musculaires à cet âge par rapport aux animaux témoins traités par GFP (Fig. 4 c et d). Ces résultats ont démontré que l’inhibition de la myostatine par le traitement par FS était bénéfique chez les animaux mdx âgés qui avaient subi de multiples cycles de dégénérescence et de régénération musculaires. La traduction à un parallèle clinique suggère que la thérapie génique FS médiée par AAV pourrait avoir un potentiel pour le patient DMD âgé, indépendamment du remplacement du gène manquant et pourrait avoir un rôle potentiel dans la thérapie combinée similaire à celle démontrée pour le remplacement du gène de l’IGF-1 et de la minidystrophine (25).

Ces résultats suggèrent que l’inhibition de la myostatine par FS-344, délivrée par une seule injection AAV1 peut améliorer la taille et la force musculaire et est bien tolérée pendant >2 ans. Les résultats de FS344 peuvent offrir une stratégie plus puissante que d’autres ciblant uniquement la myostatine en raison d’effets additifs, tels que l’implication de la follistatine dans de multiples voies de signalisation, et la découverte récente démontrant une réduction de l’inflammation dans un modèle d’endotoxémie (15, 26). La capacité frappante de la SF à apporter une amélioration brute et fonctionnelle à long terme aux muscles dystrophiques chez les animaux âgés justifie sa prise en compte dans le développement clinique pour traiter les maladies musculo-squelettiques, y compris chez les patients DMD âgés.