Rôle de Candida dans la diarrhée associée aux antibiotiques

Abstract

Pour évaluer quantitativement le rôle des espèces de Candida dans la diarrhée associée aux antibiotiques (DAA), des échantillons de selles provenant d’un total de 395 patients et de sujets témoins ont été cultivés dans un milieu d’isolement différentiel : 98 patients présentaient une DAA, 93 patients prenaient des antibiotiques mais n’avaient pas de diarrhée (A+D-), 97 patients ne prenaient pas d’antibiotiques mais avaient une diarrhée (A-D+) et 107 patients étaient des sujets témoins (A-D-). En outre, la production d’aspartyl protéinase sécrétée (Sap) a été testée. Chez les patients AAD, la positivité de Candida (77/98) et la surcroissance de Candida (62/98) n’étaient pas différentes de celles des patients A+D- (75/93 et 52/93, respectivement). La prolifération de Candida chez les patients A-D+ (40/97, P=.003) était moins fréquente que chez les patients AAD, mais la positivité de Candida n’était pas différente (80/97, P=.612). Chez les sujets témoins, la positivité et la prolifération de Candida étaient moins fréquentes que dans tous les autres groupes. La production de Sap ne différait pas entre les patients atteints de DAA et les sujets témoins (P=.568 et P=.590, respectivement). Les données indiquent que les numérations élevées de Candida sont le résultat d’un traitement antibiotique ou d’une diarrhée plutôt qu’une cause de DAA

Le muguet buccal et l’œsophagite sont les manifestations pathologiques les plus courantes des infections à Candida . Le rôle de Candida dans la diarrhée associée aux antibiotiques (DAA) a été débattu . On considère que des concentrations fécales d’espèces de Candida de ⩾105 cfu/mL de selles sont à l’origine de la diarrhée chez les patients après une antibiothérapie. Il a été rapporté que des patients ayant reçu des antibiotiques sans développer de diarrhée avaient <105 cfu Candida fungi/mL de selles

Les aspartyl protéases sécrétées (Saps) sont des facteurs de virulence importants produits par les espèces de Candida. Les Saps sont impliquées dans l’adhérence de Candida albicans aux muqueuses humaines et dans l’invasion des tissus humains. Une corrélation entre l’expression des Saps et la virulence de Candida a été démontrée dans la candidose orale et la vaginite à Candida chez les patients infectés par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH). Dans la DAA liée à Candida, la sécrétion active médiée par une toxine fongique ou des substances semblables à une toxine a été discutée comme le mécanisme pathogénique de la diarrhée. Chez C. albicans, 10 gènes SAP différents ont été identifiés. Chez Candida tropicalis, une faible activité protéolytique extracellulaire a été observée, tandis que Candida glabrata n’a aucune activité protéolytique sur gélose protéique

C. albicans est connu pour produire des protéases aspartyl lorsqu’il est cultivé dans un milieu avec des protéines comme seule source d’azote , et l’expression du gène SAP2 est principalement responsable de l’activité protéolytique observée dans la plupart des souches se développant sous forme de levure in vitro . Les Saps présentent également une activité protéolytique dans le tractus gastro-intestinal ; l’expression de SAP dans la candidose orale et la dégradation de la mucine gastro-intestinale par les Saps ont été démontrées. La dégradation de la mucine gastro-intestinale par des enzymes a été impliquée comme un déterminant de virulence pour un certain nombre d’entéropathogènes (par exemple, Vibrio cholerae, Shigella species, Helicobacter pylori et Yersinia enterocolitica). Pour C. albicans qui colonise les surfaces muqueuses, la dégradation de la mucine par SAP2 peut permettre une plus grande proximité avec les cellules épithéliales et/ou une modification des surfaces cellulaires. Des niveaux plus élevés de protéinase acide Candida sécrétoire ont été trouvés chez les enfants atteints de diarrhée aiguë et chronique que chez les sujets témoins sains

Pour élucider la pertinence pathogénique des espèces de Candida chez les patients adultes atteints de DAA, nous avons effectué des cultures de selles quantitatives pour les espèces de Candida chez 395 adultes immunocompétents. En outre, la production de Saps a été examinée

Méthodes

Sélection des patients et collecte des échantillons de sellesTous les patients d’un service médical de 250 lits ont été interrogés sur la diarrhée ou le traitement antibiotique en l’absence de diarrhée sur une base quotidienne pendant 11 mois. La diarrhée était définie comme >3 selles molles ou aqueuses par jour . Le traitement antibiotique était défini comme la réception d’antibiotiques par voie orale ou intraveineuse à des doses thérapeutiques pendant ⩾1 jour. La DAA a été définie comme >3 selles molles ou aqueuses par jour pendant ou jusqu’à 2 mois après le traitement antibiotique . Les patients ont été recrutés consécutivement dans 4 groupes d’étude jusqu’à ce que les nombres prédéterminés nécessaires à la comparaison statistique soient atteints (voir analyse statistique ci-dessous). Les patients n’ont été inclus qu’une seule fois au cours de leur admission à l’hôpital

Les échantillons de selles de tous les patients souffrant de diarrhée ont été mis en culture pour la recherche d’agents pathogènes bactériens (salmonelles, shigelles, yersinia et campylobacter) sur gélose sélective, ont été examinés pour la recherche d’ovules et de parasites, et ont été testés pour Clostridium difficile par culture sur gélose sélective et par l’utilisation du test rapide C. difficile (BD). Les patients présentant l’un de ces agents pathogènes ont été exclus de l’étude. Ainsi, 395 patients (195 avec diarrhée et 200 sans) ont été inclus dans l’étude et ont été répartis en 4 groupes : (1) groupe A+D+, 98 patients atteints de DAA recevant des antibiotiques et présentant une diarrhée ; (2) groupe A+D-, 93 patients recevant des antibiotiques mais ne présentant pas de diarrhée ; (3) groupe A-D+, 97 patients ne recevant pas d’antibiotiques mais présentant une diarrhée ; et (4) groupe A-D-, 107 sujets témoins ne recevant pas d’antibiotiques et ne présentant pas de diarrhée

Les 4 groupes ne différaient pas en termes de répartition par sexe et par âge. Les échantillons de selles de tous les sujets ont été prélevés immédiatement après une selle et ont été apportés au laboratoire dans le même bâtiment dans les 15 minutes. Les échantillons de selles évacuées pendant la nuit ont été conservés à 4°C et ont été traités le lendemain matin

Les cultures de candida et les frottis sur lameLes échantillons de selles ont été dilués au 1:10 avec du sérum physiologique, ont été remués dans un homogénéisateur de selles, puis à nouveau dilués au 1:1000 et 1:10000 avec du sérum physiologique. Cent microlitres de chaque dilution ont été transférés sur un Candida CHROMagar (BBL) et ont été étalés uniformément avec un écouvillon stérile. Après incubation à 37°C pendant 48 h à l’air ambiant, les colonies de Candida ont été comptées et classées comme C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis ou d’autres espèces de Candida, selon la couleur des colonies. Un nombre de colonies ⩾105 cfu/mL de selles a été classé comme « surcroissance de Candida », selon Danna et al. . Un frottis sur lame de chaque dilution des 100 premiers échantillons de selles consécutifs a été coloré avec du colorant de Gram et a été examiné au microscope optique pour la présence de levures et de leucocytes

Détection des SapsDes isolats consécutifs de Candida provenant des groupes de patients A-D- et A+D+ ont été testés pour la sécrétion d’aspartyl protéase dans une gélose à l’albumine de sérum bovin (BSA) (1,17% de base de carbone de levure , 0,01% d’extrait de levure , et 0,2% de BSA ), comme décrit ailleurs . Le milieu a été ajusté à pH 5,0, a été stérilisé par filtration (taille des pores, 0,2 μm), et a été ajouté à une solution mère de gélose autoclavée (2 %). La protéolyse, indiquant l’activité enzymatique, a été mesurée en millimètres et a été notée comme suggéré ailleurs : – ou ± (aucune clarification visible ou très limitée de la gélose autour de la colonie n’était présente), 1+ (une protéolyse appréciable était observée) et 2+ (la clarification de la gélose dépassait largement la marge de la colonie). La souche SC5314 de C. albicans et un mutant nul SAP2 (fourni par B. Hube, Université de Hambourg, Allemagne) ont été étudiés en tant que témoins

Analyse statistiqueUn nombre de patients présentant des numérations de Candida différentes dans différents groupes a été comparé à l’aide du test χ2, et les numérations de levures sur les frottis sur lame ont été corrélées aux numérations de Candida provenant des cultures à l’aide de la corrélation de Pearson. Les différences de production de Sap ont été calculées à l’aide des tests t de Student et exact de Fisher. La taille de l’échantillon pour le test de culture a été calculée comme étant de 91 patients évaluables, et pour le test de Sève, elle a été calculée comme étant de 20 patients évaluables par groupe, avec un α de 0,05 et une puissance de 0,8 (SigmaStat, version 2.0 ; Jandel Scientific). Les différences avec P<.05 ont été considérées comme significatives

Résultats

Cultures de Candida et frottis sur lameLes résultats des cultures de Candida sont présentés dans la figure 1. Dans le groupe A+D+, la positivité de Candida (chez 77/98 patients) et la surcroissance de Candida (chez 62/98 patients) n’étaient pas significativement différentes de celles du groupe A+D- (75/93 patients et 52/93 patients , respectivement). Dans le groupe A-D+, la prolifération de Candida était significativement moins fréquente que dans le groupe A+D+ (P=.003), mais la positivité de Candida n’était pas significativement différente (P=.612). La positivité et la prolifération de Candida étaient significativement moins fréquentes dans le groupe A-D- que dans tous les autres groupes (positivité de Candida : 66/107 patients, P=.013, par rapport au groupe A+D+ ; P=.005, par rapport au groupe A+D- ; et P=.002, par rapport au groupe A-D+ ; prolifération de Candida : 15/107 patients, P<.001, par rapport à tous les autres groupes ; figure 1)

Les analyses exploratoires utilisant différents seuils pour la définition de la surcroissance de Candida (103, 104, 106 ou 107 cfu/mL de selles) ont donné des résultats qualitativement similaires. Dans tous les calculs, la prolifération de Candida était significativement moins fréquente dans le groupe A-D- que dans tous les autres groupes. C. albicans était l’isolat le plus fréquent (216 patients sur 395), suivi de C. glabrata (104 patients sur 395), C. tropicalis (21 patients sur 395), C. krusei (11 patients sur 395) et d’autres espèces de Candida (97 patients sur 395). Des cultures mixtes de Candida ont été trouvées chez 122 (31 %) des 395 patients. Les numérations de levures sur frottis sur lame n’étaient pas corrélées aux numérations des cultures (r=.27 ; figure 2)

Résultats de l’activité protéolytique sur la gélose BSAEn tout, 23 isolats de Candida A+D+ et 20 A-D-C ont été testés pour l’activité protéolytique dans la gélose BSA. L’activité moyenne±DS était de 1,26±1,06 mm pour le groupe A+D+ et de 1,42±0,64 mm pour le groupe A-D-. Sur les 23 isolats A+D+, 16 avaient un score de protéolyse de 1+ (zone de clarification de 1 à 2 mm) et 1 avait un score de 2+ (zone de clarification de 3 à 5 mm), indiquant tous deux la présence d’une activité protéinase enzymatique. Sur les 20 isolats A-D-, 17 avaient un score de protéolyse de 1+ et 2 avaient un score de 2+. Tous les isolats de C. albicans présentaient des zones de clarification sur milieu BSA (⩾1 mm, score ⩾1+). Dans le groupe A-D-, 1 isolat de C. tropicalis n’a présenté aucune protéolyse. Dans le groupe A+D+, 5 isolats de C. glabrata et 1 isolat de C. tropicalis n’ont présenté aucune protéolyse. Les zones de clarification des groupes A-D- et A+D+ n’étaient pas significativement différentes lorsqu’elles étaient mesurées en millimètres (P=.568, test t de Student) ou avec le système de notation 1+/2+ (P=.294 et P=.590 pour les isolats notés 1+ et 2+, respectivement, test exact de Fisher). Lorsque les isolats de C. glabrata (qui sont connus pour être négatifs sur la gélose protéique) ont été supprimés, il n’y avait pas de différence significative dans la production de Sap entre les groupes (P=.347)

Discussion

La surcroissance de Candida a été postulée pour causer la DAA . Nous avons étudié la présence et la quantité d’espèces de Candida chez des patients soupçonnés de souffrir de DAA, des patients sans diarrhée mais prenant des antibiotiques, des patients avec diarrhée mais ne prenant pas d’antibiotiques, et des patients sans diarrhée et ne prenant pas d’antibiotiques (sujets témoins). Une proportion significativement plus élevée d’échantillons de selles provenant de patients sous traitement antimicrobien et souffrant de diarrhée (groupe A+D+) étaient positifs pour les espèces de Candida et présentaient un nombre de colonies plus élevé que les échantillons provenant de sujets témoins (groupe A-D-). Dans une étude de Danna et al, une surcroissance de Candida (⩾105 cfu/mL de selles) a été observée chez 7 (29 %) des 24 patients atteints de DAA. Dans cette étude, 0 des 24 patients sans diarrhée mais recevant des antibiotiques présentait une surcroissance de Candida . Cependant, dans notre étude, 52 (56 %) des 93 patients sous antibiotiques mais sans diarrhée présentaient une prolifération de Candida, et aucune différence n’a été observée par rapport aux patients atteints de DAA. Étant donné que nous avons étudié un nombre presque quadruplé de patients (93 contre 24), les différences entre nos résultats et ceux de Danna et al. peuvent être dues à la taille plus importante de l’échantillon dans notre étude

Pour évaluer l’influence de la diarrhée sur le nombre de Candida intestinaux, nous avons également étudié les patients ne recevant pas d’antibiothérapie mais souffrant de diarrhée (groupe A-D+). Dans ce groupe, la surcroissance de Candida (⩾105 cfu/mL de selles) était significativement moins fréquente que chez les patients AAD, mais la positivité de Candida n’était pas significativement différente. Des études antérieures ont montré que la flore normale des selles était nettement réduite chez les patients atteints de DAA. Dans les études portant sur les effets des antibiotiques à large spectre sur la composition de la microflore intestinale de l’homme, une corrélation inverse significative entre le log de l’augmentation maximale des levures et le log de la diminution maximale des anaérobies a été observée. Puisque nous avons trouvé une augmentation de la positivité de Candida chez les patients AAD, les patients A+D- et les patients A-D+, nous suggérons que la diminution des bactéries dans les selles, due soit à l’antibiothérapie, soit à la dilution dans la diarrhée, a permis aux espèces de Candida de se développer, ce qui a entraîné une augmentation du nombre de positivité de Candida

Dans notre étude, le nombre moyen de levures sur les frottis colorés par la coloration de Gram n’était pas corrélé avec les cultures de Candida lorsqu’il était calculé soit avec le nombre total de levures sur les frottis sur lame (r=.27) ou avec l’indice suggéré par Danna et al. (r=.12). La discordance entre le grand nombre de cellules levuriformes comptées au microscope optique et la croissance faible ou absente des espèces de Candida a été rapportée ailleurs 15]. Dans cette étude, les auteurs ont présumé qu’une grande majorité des levures détectées au microscope dans les selles n’étaient pas vivantes. Nos résultats indiquent qu’il faut faire preuve d’une grande prudence dans l’interprétation des échantillons de selles des patients atteints de DAA et positifs pour les espèces de Candida. L’utilité de l’analyse des selles pour la numération des Candida par culture ou frottis sur lame chez ces patients est sérieusement remise en question. L’absence de leucocytes dans les échantillons colorés avec la coloration de Gram était conforme aux résultats précédents . Nos résultats ont également confirmé que les espèces de Candida faisaient partie de la flore intestinale normale

Une sécrétion active médiée par une toxine fongique ou des substances ressemblant à des toxines a été discutée comme le mécanisme de la DAA liée à Candida . Les SAP étant les principaux facteurs de virulence des infections à Candida , nous avons étudié ces protéinases in vitro. À ce jour, 10 gènes SAP différents ont été identifiés chez C. albicans . Étant donné qu’il a été signalé que la SAP contribue aux dommages tissulaires dans un modèle de candidose orale humaine, ces protéinases peuvent également endommager les cellules épithéliales intestinales. Mais chez 8 patients soupçonnés d’avoir une DAA liée à Candida, il n’y avait aucune preuve de colite ou de dommages cellulaires

Dans notre étude, toutes les souches de C. albicans étudiées ont produit des Saps, et il n’y avait pas de différence significative entre la quantité de Saps produite dans les isolats de Candida provenant de patients atteints de DAA et de sujets témoins. Des niveaux plus élevés de protéinases acides sécrétoires de Candida ont été trouvés chez les enfants atteints de diarrhée aiguë et chronique que chez les sujets témoins sains . Bien que les niveaux de Sap calculés pour l’ensemble du groupe d’enfants souffrant de diarrhée aiguë ou chronique étaient significativement plus élevés que ceux des sujets témoins, ce n’était pas le cas pour les cas individuels. Sur 9 isolats de Candida, 4 provenant de sujets témoins (enfants sans diarrhée) présentaient des niveaux de Sap comparables à ceux des enfants atteints de diarrhée chronique, et 2 des 9 sujets témoins présentaient des niveaux comparables à ceux des enfants atteints de diarrhée aiguë. Malgré ces niveaux élevés de Sap, les sujets témoins ne souffraient pas de diarrhée. Ces résultats contrastent avec ceux d’études antérieures, dans lesquelles la production de Sap chez les patients symptomatiques atteignait toujours des niveaux plus élevés que chez les sujets témoins : La production de Sap par les espèces de Candida provenant de patientes atteintes de vaginite dépassait toujours la production de Sap par les Candida provenant de porteuses, et les souches de Candida provenant de candidoses orales chez les patients atteints du SIDA produisaient ∼8 fois plus de Sap que les isolats des sujets témoins

La production de Sap est indiquée de manière cohérente par le test BSA en gélose et ELISA . En outre, les niveaux élevés de Sap sécrétés in vitro et détectés par le test BSA agar ou ELISA sont corrélés à des niveaux accrus de Sap in vivo (par exemple, dans les fluides vaginaux de patients séropositifs atteints de vaginite) . On peut supposer que les espèces de Candida produisent temporairement des niveaux élevés de Sap in vivo mais perdent cette capacité en raison, par exemple, de la sous-culture. Chez C. albicans isolé des cavités buccales, il a été démontré que la production élevée de Sève était une caractéristique stable. D’autre part, les isolats de C. albicans avec une faible production de protéinase ont montré une production de Sève stable et de faible niveau lors de sous-cultures répétées

En résumé, les résultats de notre étude ne confirment pas les mécanismes pathogéniques précédemment suggérés de la DAA liée à Candida . Nos données indiquent que l’élévation du nombre de Candida est un résultat du traitement antibiotique ou de la diarrhée en soi plutôt qu’une cause de DAA. La production du principal facteur de virulence fongique Sap chez les patients atteints de DAA ne différait pas de celle des sujets témoins, ce qui indique que cette toxine fongique n’est peut-être pas responsable de la DAA chez les adultes. D’autres facteurs de virulence fongiques (par ex. phospholipases) warrant further investigation