Aumento a lungo termine della massa e della forza del muscolo scheletrico mediante la somministrazione di un singolo gene di inibitori della miostatina
Risultati e discussione
La consegna genica mediata da AAAV al muscolo fornisce un sistema per generare alti livelli di proteine nel tessuto bersaglio o mediante un prodotto secreto trasportato in siti remoti attraverso la circolazione (19). Abbiamo clonato i noti geni secreti inibitori della miostatina, tra cui la proteina di siero associata al fattore di crescita e differenziazione-1 (GASP-1) (18), il gene legato alla follistatina (FLRG) (17), e la follistatina-344 (FS) (13) in AAV sierotipo 1, che hanno dimostrato elevate capacità di trasduzione muscolare. Ci sono due isoforme di follistatina generate da splicing alternativo. La variante FS-344 subisce la scissione del peptide per generare l’isoforma FS-315 e l’altra variante FS-317 produce l’isoforma FS-288 dopo la scissione del peptide. Abbiamo usato la variante umana FS-344, che genera esclusivamente l’isoforma FS-315 circolante nel siero di FS e include una regione acida C-terminale (20). Abbiamo scelto FS-344 (FS), perché l’altra isoforma FS-317, priva della terminazione C, mostra localizzazione preferenziale al fluido follicolare ovarico e alta affinità di legame al tessuto attraverso proteoglicani eparina solfato, che possono influenzare la capacità riproduttiva e legarsi ad altri siti off-target (21). FS-288 rappresenta la forma legata alla membrana della follistatina (22), è un potente soppressore dell’ormone follicolo stimolante ipofisario (23), si trova nel fluido follicolare dell’ovaio e nei testicoli, e dimostra un’alta affinità per le cellule della granulosa dell’ovaio.
Abbiamo cercato di determinare l’efficacia di queste proteine per aumentare la massa muscolare in topi normali e distrofici. Abbiamo somministrato 1 × 1011 particelle virali AAV1 per animale che codificano FS, FLRG, GASP-1, o GFP bilateralmente nei muscoli quadricipite e tibiale anteriore di topi wild-type C57BL/6 di 4 settimane. Tutti gli animali trattati con gli inibitori della miostatina hanno dimostrato un aumento della massa corporea con un miglioramento lordo osservabile dei muscoli quando analizzati a 725 giorni di età rispetto ai controlli trattati con GFP (Fig. 1 a e b). La valutazione del peso dei singoli muscoli ha mostrato un aumento della massa muscolare per tutti gli animali trattati con inibitori della miostatina, con il maggiore aumento negli animali trattati con FS. L’aumento della massa muscolare è stato trovato nei muscoli dell’arto posteriore iniettato e nei muscoli remoti al sito di iniezione, come il tricipite. Così, questi inibitori sono stati secreti nella circolazione dal sito di iniezione del muscolo, aumentando la massa muscolare scheletrica in siti remoti (Fig. 1 c). L’aumento della massa muscolare è stato accompagnato da un miglioramento funzionale dimostrato da un aumento della forza di presa degli arti posteriori (Fig. 1 d). Non ci sono stati effetti sulla massa del cuore o sull’aspetto istologico dei cardiomiociti, indicando che l’inibizione della miostatina era selettiva per il tessuto muscolare scheletrico (dati non mostrati). C’è stata la preoccupazione che FS effetti negativi sulla funzione gonadica. Non abbiamo trovato alcun cambiamento nella capacità riproduttiva nei topi trattati con il nostro AAV1 che trasporta il transgene FS344 (AAV1-FS, Tabella 1) Inoltre, non abbiamo trovato alterazioni istologiche/patologiche nel tessuto gonadico dei topi trattati FS rispetto ai controlli (dati non mostrati).
Le proteine inibitrici della miostatina aumentano la massa muscolare e la forza nei topi C57BL/6 wild-type. (a) La massa muscolare lorda degli arti posteriori è aumentata in tutti i topi trattati con proteine inibitrici della miostatina a 725 giorni di età rispetto ai controlli iniettati con AAV1-GFP. (b) La massa corporea totale è significativamente aumentata nei topi iniettati con AAV1-FS (**, P ≤ 0.01) e AAV1-GASP-1 (*, P ≤ 0.05) rispetto ai controlli AAV1-GFP a 725 giorni di età (n = 10). (c) La massa dei singoli muscoli dell’arto posteriore e anteriore è aumentata nei topi iniettati con AAV che esprimono proteine inibitrici della miostatina (n = 10). *, P ≤ 0.05. (d) la forza di presa degli arti posteriori migliora > 2 anni in tutti i topi trattati con le maggiori differenze negli animali trattati con AAV1-FS rispetto ai controlli AAV1-GFP (n = 10). Le barre di errore rappresentano l’errore standard.
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Riproduzione era normale negli animali trattati con AAV1-FS
Dati gli effetti robusti di consegna FS, abbiamo poi testato il potenziale per AAV1-FS consegnato postnatale in un paradigma clinicamente significativo per aumentare la massa e la forza muscolare e ritardare il deterioramento muscolare nel modello murino mdx di distrofia muscolare di Duchenne (DMD). La DMD è una malattia recessiva legata al cromosoma X che provoca il deperimento dei muscoli scheletrici e della funzione cardiaca, portando infine alla morte. Recentemente, la FS è stata studiata in animali mdx che sovraesprimono un dominio duplicato del gene della follistatina. I risultati hanno dimostrato un aumento della massa muscolare e una patologia attenuata, anche se i risultati sono stati documentati solo a 15 settimane di età (24). Nei nostri studi, gli animali mdx sono stati iniettati bilateralmente nei muscoli quadricipite e tibiale anteriore con una dose bassa (1 × 1010 particelle virali) o alta (1 × 1011 particelle virali) di AAV1-FS a 3 settimane di età e seguiti per 5 mesi prima della necroscopia. Aumentati livelli di FS circolanti sono stati rilevati nel siero di entrambi gli animali trattati a bassa e alta dose con la dose alta esprimendo i più grandi livelli di FS rilevato nel siero (alta dose, 15.3 ± 2.1 ng/ml; bassa dose, 6.8 ± 0.4 ng/ml; controlli GFP, 0 ± 0.1 ng/ml; n = 8 per gruppo; P < 0.01). Abbiamo dimostrato che AAV1-FS ha aumentato la massa corporea rispetto ai controlli trattati con GFP, con il maggiore aumento nel gruppo FS ad alta dose (dati non mostrati). Osservazione lordo di AAV1-FS trattati topi visualizzato un aumento significativo delle dimensioni del muscolo rispetto a AAV1-GFP trattati animali (Fig. 2 a), con il più grande aumento di peso muscolare individuale in alta dose FS-trattati animali (Fig. 2 b). Gli effetti non erano limitati ai muscoli iniettati; sono stati trovati anche in siti remoti dai muscoli direttamente mirati (Fig. 2 b). Aumento della massa muscolare tradotto in una dose-dipendente miglioramento della forza muscolare negli arti posteriori e anteriori degli animali trattati rispetto ai controlli trattati GFP (Fig. 2 c). Analisi istologiche e morfometriche di AAV1-FS muscoli iniettati e in siti remoti dimostrato ipertrofia miofibre, sostenendo osservazioni lordo fatto al momento della necroscopia (Fig. 3 a-c). Inoltre, non c’era alcun cambiamento nei tipi di fibre muscolari negli animali trattati con AAV-FS; tuttavia, c’erano meno fibre totali per millimetro quadrato di area nel muscolo tibiale anteriore negli animali trattati con l’alta dose AAV-FS (Fig. 3 d ed e). Sorprendentemente, i topi trattati con FS hanno dimostrato una significativa riduzione della creatina chinasi nel siero rispetto ai controlli trattati con GFP (Fig. 4 a). Questo è di interesse, perché FS è stato protettivo nonostante la sua mancanza di correzione del deficit di distrofina sottostante. Il meccanismo esatto non è chiaro, ma si potrebbe ipotizzare che l’aumento della forza delle singole fibre le rende meno suscettibili ai danni dello stress delle normali attività. Il coinvolgimento delle cellule satelliti nell’inibizione postnatale della miostatina rimane da risolvere completamente; tuttavia, non abbiamo visto un cambiamento statistico nei marcatori delle cellule satelliti muscolari per gli animali trattati con FS (dati non mostrati).
Singola iniezione di AAV1-FS aumenta la massa muscolare e la forza in giovani topi mdx. (a) La massa muscolare lorda degli arti posteriori è aumentata negli animali mdx iniettati con AAV1-FS a 180 giorni di età rispetto ai controlli iniettati con AAV1-GFP. (b) La massa dei singoli muscoli degli arti posteriori e anteriori è aumentata a 180 giorni di età nei topi iniettati a 3 settimane di età con AAV1-FS rispetto ai controlli AAV1-GFP (n = 15). *, P ≤ 0.05. (C) la forza di presa è migliorata in modo dose-dipendente in giovani topi mdx iniettati a 3 settimane di età con AAV1-FS seguito per 180 giorni (n = 15). Rosso, alta dose AAV1-FS; blu, bassa dose AAV1-FS; verde, AAV1-GFP controlli. Le barre di errore rappresentano gli errori standard.
topi mdx trattati con AAV1-FS a 3 settimane di età e seguiti per 180 giorni dimostrano ipertrofia miofibra. (a) H& colorazione E del tibiale anteriore rivela ipertrofia delle miofibre nel muscolo iniettato AAV1-FS rispetto al controllo AAV1-GFP. (Ingrandimento originale, ×40.) (b) Il diametro medio delle miofibre scure (ossidative a contrazione lenta), intermedie (glicolitiche ossidative a contrazione rapida) e chiare (glicolitiche a contrazione rapida) nel tibiale anteriore (indicato dalla linea tratteggiata) è significativamente aumentato nei topi iniettati con AAV1-FS rispetto ai controlli iniettati con AAV1-GFP. (P < 0.001; n = 5). (c) Il diametro medio delle miofibre intermedie e leggere (indicate dalla linea tratteggiata) nel tricipite è significativamente aumentato nei topi iniettati con AAV1-FS rispetto ai controlli iniettati con AAV1-GFP. (P < 0.001; n = 5.) (d) La distribuzione delle fibre scure, intermedie e chiare come determinato da succinico deidrogenasi (SDH) colorazione non è cambiato dal trattamento con alte o basse dosi di AAV1-FS. (P > 0.05 tra tutti i gruppi; n = 5.) (e) Il numero medio di fibre contate per una cornice di conteggio imparziale 0.14 mm2 è diminuito nel tibiale anteriore dei topi trattati con AAV1-FS, dato che il diametro medio delle miofibre è aumentato. (*, P < 0.01; n = 5.) Le barre di errore rappresentano gli errori standard.
topi mdx trattati con AAV1-FS mostrano diminuito marcatori di danno muscolare e mdx invecchiati sono sensibili al trattamento FS con beneficio funzionale. (a) I livelli sierici di creatina chinasi (unità/litro) sono diminuiti a 3 mesi dopo l’iniezione di AAV1-FS rispetto ai controlli iniettati con AAV1-GFP. (*, P < 0.05; n = 10.) Le barre di errore rappresentano gli errori standard. (B) la forza di presa degli arti posteriori è significativamente aumentata (P ≤ 0.05) a 275 giorni e oltre nei topi mdx invecchiati trattati con AAV1-FS a 210 giorni di età (n = 15). Rosso, ad alto dosaggio AAV1-FS; verde, AAV1-GFP controlli. (c) H& macchia di gastrocnemio invecchiato dimostra ridotta patologia quando iniettato a 210 giorni di età con FS rispetto ai controlli GFP-iniettato. (Ingrandimento originale, ×40.) (d) H& E macchiato diaframma di animali iniettati a 210 giorni di età con FS mostra meno sostituzione di grasso che GFP-iniettato controlli in fase avanzata. (Ingrandimento originale, ×20.)
Abbiamo anche valutato il potenziale di AAV1-FS per aumentare la forza muscolare negli animali mdx quando trattati in età più avanzata. Abbiamo trovato che l’iniezione di AAV1-FS a 210 giorni di età ha aumentato la forza muscolare ≈60 giorni dopo la somministrazione e che l’aumento della forza è persistito a lungo termine per tutti i 560 giorni valutati in questo studio (Fig. 4 b). Già 180 giorni di età, prima del trattamento AAV1-FS, c’era una patologia evidente nei muscoli degli animali mdx non trattati, con prominente proliferazione del tessuto connettivo endomisiale e infiammazione (Fig. 4 c e d). La valutazione patologica dei muscoli del gastrocnemio e del diaframma a 560 giorni di età ha dimostrato che gli animali trattati con AAV1-FS avevano sostanzialmente meno gruppi focali di fibre muscolari necrotiche e infiltrati di cellule mononucleari. È importante notare che gli animali trattati con AAV1-FS avevano aree focali significativamente ridotte di proliferazione del tessuto connettivo endomisiale, che erano pronunciate negli animali trattati con GFP, dimostrando che la fibrosi, un segno distintivo della distrofia muscolare, era diminuita negli animali trattati con FS (Fig. 4 c). Patologia nel diaframma ha anche mostrato che FS-trattamento ridotto infiammazione e sostituzione grassa rispetto agli animali trattati con GFP (Fig. 4 d). Inoltre, AAV1-FS trattamento dimostrato significativi aumenti dei diametri delle fibre muscolari a questa età rispetto al controllo GFP-trattati animali (Fig. 4 c e d). Questi risultati hanno dimostrato che l’inibizione della miostatina dal trattamento FS è stato utile in animali mdx invecchiati che avevano subito più cicli di degenerazione e rigenerazione muscolare. La traduzione in un parallelo clinico suggerisce che la terapia genica FS mediata da AAV potrebbe avere un potenziale per il paziente DMD anziano indipendente dalla sostituzione del gene mancante e potrebbe avere un ruolo potenziale nella terapia combinata simile a quella dimostrata per la sostituzione del gene IGF-1 e minidistrofina (25).
Questi risultati suggeriscono che l’inibizione della miostatina da FS-344, fornita da una singola iniezione AAV1 può migliorare la dimensione e la forza muscolare ed è ben tollerata per >2 anni. I risultati di FS344 possono offrire una strategia più potente di altre che hanno come obiettivo solo la miostatina a causa di effetti additivi, come il coinvolgimento della follistatina in più vie di segnalazione, e la recente scoperta che dimostra una riduzione dell’infiammazione in un modello di endotossinemia (15, 26). La sorprendente capacità della FS di fornire un miglioramento grossolano e funzionale a lungo termine ai muscoli distrofici negli animali anziani giustifica la sua considerazione per lo sviluppo clinico per il trattamento delle malattie muscolo-scheletriche, compresi i pazienti DMD più anziani.