Biologia cellulare@Yale

Contenuto della lezione

Organelli legati alla membrana

Le cellule eucariotiche contengono collezioni di proteine che funzionano come un’unità chiamata organelli. Alcuni di questi organelli sono circondati da una membrana simile nella struttura alla membrana cellulare ma con una diversa composizione di proteine e fosfolipidi.

Gli organelli legati alla membrana offrono diversi vantaggi alle cellule eucariotiche. In primo luogo, le cellule possono concentrare e isolare enzimi e reagenti in un volume più piccolo, aumentando così il tasso e l’efficienza delle reazioni chimiche. In secondo luogo, le cellule possono confinare proteine e molecole potenzialmente dannose negli organelli legati alla membrana, proteggendo il resto delle cellule dai loro effetti nocivi. Per esempio, il lisosoma, che è un organello legato alla membrana, contiene molti enzimi che digeriscono proteine, acidi nucleici e lipidi. Se questi enzimi fossero rilasciati nel citosol, potrebbero masticare le proteine, gli acidi nucleici e i lipidi della cellula, portando alla morte cellulare. La membrana che circonda il lisosoma tiene questi enzimi digestivi lontani dal resto della cellula.

Organelli e proteine non sono di solito distribuiti a caso in tutta la cellula, ma sono organizzati localizzandoli in regioni dove sono necessari. La cellula utilizza i microtubuli e le proteine motrici per aiutare a localizzare gli organelli. I microtubuli sono lunghi filamenti che si estendono nel citoplasma. Due tipi di proteine motrici, cinesine e dineine, camminano lungo i microtubuli e generano forza per tirare gli organelli attraverso il citoplasma.

I microtubuli sono polimeri di un eterodimero di alfa e beta tubullina. La tubulina polimerizza in protofilamenti lineari e un microtubulo contiene 13 protofilamenti disposti in un cilindro con un nucleo cavo. I microtubuli sono polarizzati in un’estremità negativa e un’estremità positiva. I microtubuli crescono dalle loro estremità positive aggiungendo altre subunità di tubulina. Le estremità meno dei microtubuli sono instabili e sono stabilizzate dalle proteine del centro organizzatore dei microtubuli (MTOC). Se il MTOC si trova al centro della cellula, i microtubuli si irradiano verso l’esterno con le loro estremità positive verso la membrana plasmatica

Kinesine e dineine camminano lungo i microtubuli utilizzando l’energia dell’idrolisi dell’ATP. Entrambi i gruppi di proteine contengono domini motori che legano i microtubuli e idrolizzano l’ATP. I domini motori generano il movimento lungo i microtubuli. La maggior parte delle cinesine cammina verso l’estremità più dei microtubuli, mentre la dineina cammina verso l’estremità meno. Questo dà alle cellule due strumenti per controllare la distribuzione degli organelli lungo i microtubuli. Cinesine e dineine contengono anche un dominio di legame al carico che le collega a diversi organelli. Le cinesine sono una grande famiglia di proteine e il dominio di legame al carico è il più divergente, permettendo ai diversi membri della famiglia delle cinesine di legare diversi organelli. La dineina è un grande complesso di diverse proteine e il modo in cui lega il carico è meno chiaro.

Anche i filamenti di actina supportano il trasporto di materiale cellulare, ma su distanze molto più brevi dei microtubuli. I filamenti di actina sono un polimero di actina che è una piccola proteina globulare. Il filamento di actina è una matrice elicoidale di actina e simile ai microtubuli ha un’estremità positiva e negativa, con i filamenti che crescono più facilmente dalle loro estremità positive. I filamenti di actina mancano dei contatti laterali estesi dei microtubuli e di solito sono molto più corti dei microtubuli. I filamenti di actina tendono a localizzarsi vicino alla membrana cellulare dove forniscono supporto strutturale.

Le miosine sono una classe di proteine motore che possono generare forza lungo i filamenti di actina. Alcune miosine sono coinvolte nella contrazione cellulare (cioè la contrazione dei muscoli), mentre altre supportano il movimento e il posizionamento degli organelli. Le miosine di classe V sono coinvolte nel trasporto di organelli in diversi tipi di cellule. Simile alla struttura della chinesina, le miosine di classe V contengono un dominio motore che lega i filamenti di actina e usa l’energia dell’idrolisi dell’ATP per camminare lungo i filamenti. Il C-terminale della miosina V lega gli organelli.

Per trasportare e posizionare gli organelli, le cellule usano spesso sia microtubuli che filamenti di actina. I microtubuli, le chinesine e le dine sono usati per spostare gli organelli su lunghe distanze (diversi micron o più), mentre i filamenti di actina trasportano gli organelli su brevi distanze (ad esempio vicino alla membrana plasmatica). Spesso un organello conterrà più di un tipo di proteina motrice (per esempio kinesina e miosina V) per permettere alle cellule di utilizzare entrambe le serie di filamenti per posizionare l’organello.

Signal Sequences

Per mantenere l’identità e la funzione dei diversi organelli e della membrana plasmatica, le cellule devono indirizzare proteine specifiche agli organelli e ad altri compartimenti intracellulari. La maggior parte di queste proteine contengono una breve sequenza, chiamata sequenza di segnale, che determina la loro posizione intracellulare. Le sequenze di segnale possono essere localizzate ovunque in una proteina, ma spesso si trovano nell’N-terminale. Le sequenze di segnale che indirizzano le proteine allo stesso organello spesso non condividono la stessa sequenza primaria. Di solito sono le proprietà biochimiche generali della sequenza che determinano se essa indirizza una proteina a un organello. Le sequenze di segnale sono usate per importare sia proteine solubili che proteine integrali di membrana.

Importazione delle proteine negli organelli legati alla membrana

Perché le membrane che circondano gli organelli limitano il passaggio delle proteine, gli organelli hanno sviluppato diversi meccanismi per importare le proteine dal citoplasma. La maggior parte degli organelli contiene un insieme di proteine di membrana che formano un poro. Questo poro permette il passaggio delle proteine con la sequenza di segnale corretta. Alcuni pori (ER, mitocondri) possono ospitare solo proteine non ripiegate, mentre altri pori (nucleo, perossisoma) permettono il passaggio di proteine ripiegate.

Targeting Proteine al Reticolo Endoplasmatico

Le proteine destinate alla secrezione, alla membrana plasmatica o a qualsiasi organello della via secretoria sono prima inserite nell’ER. La maggior parte delle proteine attraversano l’ER in modo co-translazionale, essendo sintetizzate dai ribosomi nell’ER. Sia le proteine solubili (proteine che risiedono nel lume degli organelli o sono secrete) che le proteine integrali di membrana sono indirizzate all’ER e traslocate con lo stesso meccanismo.

La sequenza di segnale per le proteine ER risiede di solito al N-terminale. La particella di riconoscimento del segnale (SRP), un complesso di 6 proteine e un RNA, lega la sequenza del segnale immediatamente dopo la sua traduzione. La SRP interagisce anche con il ribosoma e ferma la traduzione. La superficie delle membrane ER contiene un recettore per SRP. Il recettore SRP recluta SRP, la proteina ER nascente e il ribosoma nell’ER. Il recettore SRP rilascia la SRP dalla sequenza del segnale e permette alla traduzione di continuare sulla membrana ER.

I ribosomi sulla membrana ER si legano al traslocatore della proteina. Il traslocatore è una proteina transmembrana che forma un poro acquoso. Il poro è il canale attraverso il quale le proteine ER appena sintetizzate saranno traslocate attraverso la membrana ER. La traduzione della proteina ER genera la “forza” per spingere la proteina ER attraverso il canale.

Le proteine solubili sono completamente traslocate attraverso il canale; la sequenza di segnale rimane nel canale e viene scissa dal resto della proteina da una proteasi nel lume dell’ER.

Le proteine di membrana integrale contengono una sequenza di stop transfer a valle della sequenza di segnale. La sequenza di stop transfer cessa la traslocazione attraverso il canale e la porzione di proteina dopo la sequenza di stop transfer risiede all’esterno dell’ER. Le proteine di membrana integrale possono essere traslocate in modo che il loro N-terminale o il C-terminale risieda nel lume dell’ER. Le proteine con il loro C-terminale nel lume tendono ad avere una sequenza di segnale interna. Il traslocatore sembra aprirsi su un lato per permettere alle proteine integrali di membrana di diffondersi nel bilayer lipidico circostante.

Alcune proteine attraversano la membrana diverse volte e queste proteine contengono dopo la sequenza di stop transfer una sequenza di start transfer che reinizia la traslocazione della proteina attraverso il canale. Una proteina con una sequenza di segnale, una sequenza di stop transfer e una di start transfer attraverserebbe la membrana due volte con un anello che risiede nel citosol o nel lume. Per generare proteine che attraversano la membrana più volte, la proteina avrebbe bisogno di diverse sequenze di stop e star transfer alternate.

Una volta che le proteine entrano nell’ER, si piegano nelle loro strutture tridimensionali. Esistono diversi meccanismi che aiutano a piegare le proteine, compresi i chaperoni e la glicosilazione. L’ER contiene anche meccanismi per gestire le proteine che non riescono a ripiegarsi.

Targeting delle proteine nei mitocondri

Anche se i mitocondri contengono il loro genoma, la maggior parte delle proteine mitocondriali sono codificate da geni nucleari, il che rende necessario un meccanismo che miri e importi queste proteine nei mitocondri. Simile alle proteine importate nell’ER, le proteine mitocondriali contengono una sequenza di segnale che le indirizza ai mitocondri. A differenza delle proteine dell’ER, le proteine mitocondriali sono importate post-traslazionalmente. Poiché le proteine devono essere dispiegate per traslocare attraverso i canali della membrana mitocondriale, le proteine mitocondriali sono mantenute dispiegate nel citosol dai chaperones.

L’importazione di proteine nei mitocondri è simile all’importazione nell’ER ma è complicata dalla presenza di due membrane intorno ai mitocondri. Le proteine mitocondriali possono risiedere nella membrana esterna, nella membrana interna, nello spazio intermembrana o nella matrice (spazio all’interno della membrana interna), quindi i mitocondri hanno dei traslocatori che permettono il passaggio delle proteine attraverso la membrana esterna e la membrana interna. Il complesso TOM media il passaggio attraverso la membrana esterna, mentre il complesso TIM media il passaggio attraverso la membrana interna.

Traslocazione delle proteine nei mitocondri

La sequenza di segnale che indirizza le proteine alla matrice di solito risiede al N-terminale. La sequenza di segnale è riconosciuta dalle proteine del complesso TOM. Il complesso TOM passa le proteine nello spazio della membrana interna dove il complesso TIM nella membrana interna passa le proteine nella matrice. Il complesso TOM e TIM spesso lavorano insieme per traslocare una proteina attraverso entrambe le membrane. La traslocazione attraverso le membrane mitocondriali dipende dall’energia. I chaperon all’interno della matrice aiutano a “tirare” la proteina attraverso la membrana interna e richiedono l’idrolisi dell’ATP per funzionare. Le proteine si ripiegano all’interno della matrice.

Le proteine destinate alla membrana interna usano un meccanismo simile a quello delle proteine della matrice, ma contengono una sequenza di trasferimento di stop riconosciuta dal complesso TIM. Le proteine destinate alla membrana esterna sono traslocate attraverso la membrana esterna nello spazio intermembrana e poi importate nella membrana esterna dal traslocatore SAM. Le proteine destinate allo spazio intermembrana sono parzialmente inserite nella membrana interna e poi scisse da una proteasi e rilasciate nello spazio interno della membrana.

Importazione ed esportazione delle proteine nucleari

In contrasto con l’ER e i mitocondri, il nucleo importa principalmente proteine solubili. Inoltre, le proteine fanno spesso la spola tra il nucleo e il citoplasma e la cellula usa l’importazione/esportazione nucleare per regolare diverse vie biochimiche critiche. Il nucleo è circondato da due membrane e in queste membrane si trovano migliaia di pori nucleari attraverso i quali le proteine e altre macromolecole (RNA, ribsosomi) entrano ed escono dal nucleo. I pori nucleari sono stabilizzati nelle membrane dalle lamine, una rete citoscheletrica che sottende la membrana nucleare interna e fornisce supporto strutturale alla membrana. Il poro nucleare limita il passaggio di materiale in base alle dimensioni: le cose più piccole di ~ 30 kD si diffondono liberamente attraverso il poro, ma le molecole grandi hanno bisogno di un modo per entrare e uscire. Le proteine che entrano nel nucleo contengono un segnale di importazione nucleare e quelle che devono anche uscire dal nucleo contengono una sequenza di esportazione nucleare.

Distinguere il citoplasma dal nucleoplasma

Per generare un trasporto diretto delle proteine dentro e fuori il nucleo, le proteine devono sapere se sono nel citoplasma o dentro il nucleo. Per distinguere tra nucleo e citoplasma, le cellule usano una piccola proteina legata al GTP chiamata Ran. Come tutte le proteine che legano il GTP, Ran esiste in uno stato legato al GTP o al GDP. Due proteine catalizzano il passaggio tra questi stati. Ran-GAP (GTPase activating protein) catalizza l’idrolisi del GTP generando Ran-GDP. Ran-GEF (fattore di scambio del nucleotide di guanina) catalizza il rilascio del GDP e il reinserimento del GTP, generando Ran-GTP. Ran-GAP si localizza sul lato citoplasmatico dei pori nucleari mentre Ran-GEF si associa alla cromatina e quindi si localizza nel nucleo. Come risultato, la maggior parte di Ran nel nucleo è legata al GTP e la maggior parte di Ran nel citoplasma è legata al GDP.

Importazione nucleare

I recettori (importine) legano sequenze di importazione nucleare nelle proteine. Le importine interagiscono anche con i filamenti che si estendono dal lato citoplasmatico dei pori nucleari. Con un meccanismo sconosciuto, le importine legate al loro carico trafficano attraverso il poro nucleare. All’interno del poro il complesso importina-cargo incontra Ran-GTP. Ran-GTP dissocia le importine dal carico, liberando le proteine del carico per fare il loro lavoro nel nucleo.

Esportazione nucleare

Molte proteine che entrano nel nucleo devono essere esportate nel citoplasma (per esempio le importine). Queste proteine contengono una sequenza di esportazione nucleare che interagisce con un recettore chiamato exportin. Ran-GTP si lega a questo complesso exportin-cargo e stabilizza l’interazione. Il complesso exportin-cargo-RanGTP viaggia attraverso il poro (meccanismo non chiaro) dove incontra Ran-GAP sul lato citoplasmatico. Ran-GAP converte Ran-GTP in Ran-GDP causando la dissociazione dell’exportina dal suo carico.

Importazione di proteine nei perossisomi e sindrome di Zelleweger

I perossisomi sono piccoli organelli (~ 1 µm di diametro) che svolgono una varietà di funzioni per le cellule. I perossisomi metabolizzano le sostanze chimiche nocive (fenoli, formaldeide, etanolo), metabolizzano gli acidi grassi e catalizzano una fase della sintesi del plasmalogene che è un lipide che si trova nella mielina.

Le proteine destinate ai perossisomi contengono una sequenza di segnale che viene riconosciuta da una famiglia di proteine chiamate proteine Pex. Alcune di queste proteine Pex si legano alle sequenze di segnale, mentre altre per un poro nella membrana dei perossisomi che permette l’ingresso delle proteine perossisome.

Le cellule che contengono mutazioni nelle proteine Pex non possono importare le proteine nei perossisomi e di conseguenza, queste cellule mancano di perossisomi. Le mutazioni nelle proteine Pex sono associate a una serie di malattie chiamate sindrome di Zelleweger. Nella sindrome di Zelleweger, i bambini mancano di tono muscolare e spesso della capacità di succhiare. I bambini mostrano anche anomalie cranio-facciali e un fegato ingrossato. La prognosi per i bambini che soffrono della sindrome di Zelleweger è scarsa e la maggior parte non sopravvive oltre un anno.

Perché i perossisomi contribuiscono alla sintesi di un lipide che si trova nella mielina, i pazienti con Zelleweger spesso mostrano una scarsa mielinizzazione dei neuroni. La mielinizzazione è fondamentale per la funzione dei neuroni nel condurre i segnali alle cellule bersaglio.