Infezione da Bartonella: Trattamento e resistenza ai farmaci

Trattamento antibiotico della bartonellosi

Il trattamento delle infezioni da Bartonella con antibiotici dipende dalla presentazione clinica della malattia e dallo stato immunitario del paziente, quindi le raccomandazioni attuali per il trattamento devono essere adattate ad ogni situazione clinica.

Tecniche di test di suscettibilità agli antibiotici

Metodo di diluizione in agar Il metodo di diluizione in agar viene utilizzato per i test di suscettibilità agli antibiotici in vitro per gli isolati di Bartonella, come descritto precedentemente da Maurin et al. I ceppi di Bartonella sono stati coltivati su agar Columbia integrato con il 5% di sangue di pecora. Le colture sono state inoltre integrate con diluizioni seriali duplici dell’antibiotico di interesse. Le cellule sono state raccolte dopo 5 giorni di incubazione e sono state sospese in tampone fosfato (pH 7,4). Per i saggi antibiotici sono state utilizzate diluizioni decuplicate di sospensioni batteriche a una concentrazione equivalente a quella dello standard McFarland 0,5; la concentrazione corrisponde a circa 106 unità formanti colonie/ml, come determinato utilizzando la tecnica delle unità formanti colonie. Un totale di 10µl di ogni sospensione batterica è stato piastrato su agar integrato con sangue. Le piastre sono state incubate a 37°C in un’atmosfera di CO2 al 5%. La crescita batterica è stata valutata dopo 5 giorni di incubazione per confronto con la crescita su controlli di agar senza antibiotici. Il valore della concentrazione minima inibitoria (MIC) è definito come la prima concentrazione di antibiotico che permette l’inibizione della crescita dopo 5 giorni di incubazione.

Etest Assay Etest assay è stato recentemente utilizzato per valutare la suscettibilità agli antibiotici in Bartonella. Il gradiente di antibiotico copre un gradiente stabile, continuo ed esponenziale di concentrazione di antibiotico direttamente sotto la striscia. Dopo l’incubazione, quando la crescita batterica diventa visibile, si vede un’ellisse di inibizione simmetrica centrata lungo la striscia. La MIC (in µg/ml) viene letta direttamente dalla scala dove il bordo dell’ellisse interseca la striscia. Gli isolati di Bartonella vengono coltivati su piastre Columbia 5% sheep blood agar, e il test di suscettibilità antibiotica di tutti gli isolati di Bartonella viene eseguito utilizzando le strisce Etest disponibili per diversi antibiotici, come raccomandato dal produttore. La MIC viene misurata dopo un’incubazione di 5-12 giorni (Figura 1). Uno studio precedente ha dimostrato che i risultati della MIC ottenuti con l’Etest erano affidabili e ben correlati ai risultati ottenuti con il metodo di diluizione in agar.

Risultati di suscettibilità agli antibiotici

In base ai test in vitro, le specie di Bartonella sono suscettibili a molti antibiotici, tra cui la penicillina e altri composti a base di cefalosporine, (ad es, aminoglicosidi, cloramfenicolo, tetracicline, composti macrolidi, rifampicina, fluorochinoloni e co-trimoxazolo). Tuttavia, i risultati della sensibilità in vitro non sono sempre correlati ai dati dei pazienti in vivo; per esempio, la penicillina non ha efficacia in vivo nonostante le MIC molto basse osservate in vitro. Gli studi di suscettibilità su agar hanno anche dimostrato che molti antibiotici sono solo batteriostatici contro le specie di Bartonella in vitro. Studi precedenti hanno dimostrato che, in vitro, gli aminoglicosidi sono l’unica classe di antibiotici che sono battericidi contro le specie di Bartonella coltivate sia in terreno liquido che in cellule endoteliali.

Meccanismi di resistenza agli antibiotici in Bartonella

I principali meccanismi con cui agiscono gli agenti antimicrobici sono l’interferenza con la sintesi dell’acido nucleico, il legame al ribosoma e l’inibizione della sintesi della parete cellulare e del metabolismo dei folati. I batteri possono sviluppare resistenza agli antibiotici attraverso due processi genetici. In primo luogo, la mutazione e la selezione (trasferimento genico verticale) e in secondo luogo, lo scambio di geni tra ceppi e specie (trasferimento genico orizzontale). Per i batteri intracellulari, comprese le specie di Bartonella, la resistenza agli antibiotici è dovuta principalmente a mutazioni spontanee o mutazioni intrinseche nei geni bersaglio (cioè, trasferimento genico verticale), che sono esaminate più avanti in questo articolo. Tuttavia, abbiamo recentemente dimostrato per la prima volta la possibilità di trasferimento genico laterale di un plasmide coniugativo tra Bartonella rattaustraliani e altri batteri tra cui B. henselae o rhizobiales. Questo può suggerire che i geni di resistenza agli antibiotici potrebbero essere trasferiti lateralmente e che questo dovrebbe essere ulteriormente indagato in futuro.

Resistenza antibiotica naturale L’eterogeneità della suscettibilità di 20 nuovi isolati di Bartonella ai fluorochinoloni isolati da mammiferi australiani è stata recentemente esaminata in uno dei nostri studi. In questo studio abbiamo scoperto che la ciprofloxacina era più efficace in vitro dell’ofloxacina. Questa eterogeneità era legata a una mutazione naturale, Ser 83→Ala, nella regione determinante della resistenza al chinolone (QRDR) di gyrA. È interessante notare che uno studio di analisi del genoma in silico ha rivelato una mutazione naturale in posizione 83 della regione QRDR (Ser 83→Ala) di gyrA presente in tre specie di Bartonella (B. bacilliformis, B. quintana e B. henselae). Molti studi hanno dimostrato che le specie che portano naturalmente un residuo di serina in posizione 83 del gyrA sono solitamente suscettibili ai fluorochinoloni, mentre la presenza di un’alanina in questa posizione critica corrisponde solitamente alla resistenza naturale a questi antibiotici.

Similmente, una transizione A2059G nel gene codificante l’rRNA 23S responsabile della resistenza all’eritromicina è stata rilevata in uno dei 15 linfonodi di pazienti con CSD. Questo linfonodo è stato escisso da una donna di 10 anni che non era stata trattata con antibiotici prima dell’escissione, suggerendo che ceppi naturalmente resistenti all’eritromicina possono infettare gli esseri umani.

In vitro Resistenza agli antibiotici Recentemente, mutazioni specifiche di resistenza agli antibiotici sono state caratterizzate in B. henselae, B. quintana e B. bacilliformis, selezionate da passaggi seriali in vitro (Tabella 1).

Nelle specie di Bartonella, diversi meccanismi di resistenza all’eritromicina (Figura 2A) sono stati riportati in studi in vitro. In precedenza, abbiamo dimostrato che il ceppo completamente resistente all’eritromicina di B. quintana ottenuto dopo il 16° passaggio in vitro portava un’inserzione ripetuta di 27 basi nella proteina ribosomiale L4, risultante in un’inserzione di nove aminoacidi ripetuti tra gli aminoacidi R71 e A72 nella regione altamente conservata della proteina. Recentemente, abbiamo riportato diverse mutazioni nel gene che codifica l’rRNA 23S e la proteina ribosomiale L4 nel ceppo Marseille di B. henselae e in altri mutanti resistenti all’eritromicina di B. henselae in vitro. La maggior parte delle mutazioni nel gene 23S rRNA codificante (ad esempio, A2058G, A2058C e C2611T) sono state precedentemente dimostrate per conferire resistenza all’eritromicina in altri batteri. Abbiamo trovato mutazioni aminoacidiche in due posizioni diverse (G71R e H75Y) nella proteina ribosomiale L4 in mutanti resistenti all’eritromicina di B. henselae. Una mutazione A2058G in un ceppo resistente all’eritromicina di B. bacilliformis è stata riportata anche dal nostro team. Uno studio più recente ha dimostrato che l’azitromicina era efficace solo fino al secondo passaggio per gli isolati di B. henselae ottenuti dai gatti. Rispetto al ceppo parentale, ogni mutante di B. henselae resistente all’azitromicina aveva una sostituzione omogenea di un singolo nucleotide alla posizione 2058 (A2058G, numerazione Escherichia coli) nel gene codificante 23S rRNA.

Abbiamo anche selezionato un ceppo di B. henselae resistente alla gentamicina in vitro. Il gene codificante l’rRNA 16S, il gene candidato per la resistenza alla gentamicina (Figura 2A), è stato caratterizzato dall’analisi della sequenza. Il mutante resistente alla gentamicina di B. henselae ha portato una mutazione A1408G nel gene codificante 16S rRNA, come indicato dal doppio picco A/G. Inoltre, questa mutazione è la mutazione più frequentemente trovata in isolati clinici resistenti alla gentamicina in altre specie batteriche. Anche se abbiamo ottenuto un mutante resistente alla gentamicina in vitro, questo mutante è stato ottenuto dopo nove passaggi (18 settimane), suggerendo che la selezione di tali ceppi resistenti alla gentamicina non è probabile che avvenga in vivo.

I fluorochinoloni sono stati ampiamente utilizzati per il trattamento delle infezioni da Bartonella nell’uomo e nella medicina veterinaria. Tuttavia, i fluorochinoloni da soli non dovrebbero essere usati per il trattamento della bartonellosi poiché esiste un basso livello intrinseco di resistenza dovuto alla mutazione gyrA. Inoltre, un alto livello di resistenza ai fluorochinoloni si ottiene facilmente in vitro. L’alterazione degli enzimi bersaglio sembra essere il fattore più dominante nello sviluppo della resistenza ai chinoloni (Figura 2B). La piccola regione dai codoni 67-106 di gyrA in E. coli è stata designata come QRDR. Variazioni nella regione QRDR sono state trovate in specie con resistenza naturale ai fluorochinoloni. Nel 2003, Minnick et al. hanno isolato e caratterizzato mutanti di B. bacilliformis resistenti alla ciprofloxacina. Nel 2007, abbiamo ottenuto un ceppo di B. bacilliformis resistente alla ciprofloxacina in vitro; il ceppo conteneva una transizione da C a T in posizione 549 (numerazione E. coli) del gene gyrA, che codifica il cambiamento di aminoacido previsto Asp 87→Asn in gyrA. Questa stessa mutazione (Asp 87→Asn) è stata recentemente trovata anche in ceppi resistenti alla ciprofloxacina di B. henselae e B. quintana (tabella 1).

Un altro studio recente ha dimostrato che gli isolati di B. henselae ottenuti dai gatti sono diventati resistenti alla pradofloxacina e all’enrofloxacina (entrambi sono fluorochinoloni usati principalmente in medicina veterinaria) dopo diversi numeri di passaggi. Rispetto ai ceppi parentali di B. henselae, i mutanti resistenti alla pradofloxacina e all’enrofloxacina avevano un cambiamento di aminoacido da serina a valina in posizione 83 (numerazione E. coli) in gyrA. La mutazione Ser 83→Val trovata nei mutanti resistenti alla pradofloxacina e all’enrofloxacina in questo studio era stata riportata in precedenza da Tavío et al. in un isolato di E. coli resistente al fluorochinolone.

Infine, sostituzioni di aminoacidi nella RNA polimerasi e mutazioni puntiformi nel gene rpoB sono state dimostrate dopo la selezione in vitro di ceppi resistenti alla rifampicina (Figura 2B) di B. bacilliformis e B. quintana dal nostro gruppo. Questi ceppi hanno mostrato una mutazione alla serina 531 (Ser→Phe) nella regione che determina la resistenza alla rifampicina del gene rpoB. L’aminoacido 531 è uno dei siti più frequentemente mutati che conferiscono resistenza alla rifampicina in altre specie batteriche (tabella 1).

Trattamento della bartonellosi negli animali

Nessun antibiotico ha dimostrato di essere completamente efficace contro le infezioni da Bartonella in cani e gatti. In studi precedenti di Kordick et al., la doxiciclina e l’enrofloxacina sembravano essere efficaci contro l’infezione da Bartonella nei gatti. Nello studio, 22,7 mg di enrofloxacina sono stati somministrati per via orale ogni 12 ore e 25 mg di doxiciclina ogni 12 ore; la durata del trattamento era di 14-28 giorni. La batteriemia in gatti naturalmente infetti con infezione cronica è stata eliminata con successo da nove dei 14 gatti trattati con enrofloxacina e solo da due degli otto gatti trattati con doxiciclina. È interessante notare che l’azitromicina, un composto macrolide con una buona penetrazione intracellulare, è apparentemente diventato il farmaco di scelta per trattare cani e gatti con infezioni da B. henselae. Tuttavia, sono state segnalate ricadute dopo la sospensione dell’antibiotico anche per questo trattamento. La doxiciclina e l’enrofloxacina possono essere usate per il trattamento dei gatti e i fluorochinoloni con doxiciclina o azitromicina possono essere usati per il trattamento dei cani. Tuttavia, poiché sono stati testati molti regimi di trattamento diversi, è difficile trarre qualsiasi conclusione sull’efficacia del fluorochinolone da solo o in combinazione. Infine, anche il trattamento dei gatti contro le pulci è fondamentale per evitare la trasmissione umana.

Trattamento della bartonellosi negli esseri umani

Le raccomandazioni di trattamento per le infezioni causate da specie Bartonella sono descritte nella tabella 2. La doxiciclina e l’eritromicina sono gli antibiotici più frequentemente raccomandati per il trattamento dell’infezione da Bartonella nell’uomo, tuttavia, è stato riportato un miglioramento clinico in seguito all’uso di penicillina, gentamicina, ceftriaxone, ciprofloxacina e azitromicina.

La malattia da graffio di gatto non risponde tipicamente bene alla terapia antibiotica. Numerosi rapporti hanno valutato l’efficacia di molti agenti antimicrobici per il trattamento della tipica CSD non complicata. La maggior parte dei ricercatori non ha osservato alcun beneficio con il trattamento antibiotico, mentre rapporti aneddotici hanno indicato che la ciprofloxacina, la rifampicina e il co-trimoxazolo possono essere efficaci. In uno studio prospettico, randomizzato, in doppio cieco, controllato con placebo che ha affrontato il trattamento antibiotico della CSD nell’uomo eseguito da Bass et al., l’azitromicina somministrata per via orale per 5 giorni è stata considerata efficace nel diminuire le dimensioni dei linfonodi nelle prime 4 settimane di terapia. Tuttavia, l’allargamento di diversi linfonodi o un aumento delle dimensioni del linfonodo originale si è verificato in alcuni soggetti dello studio nonostante la terapia con azitromicina.

Nella CSD tipica, un trattamento antibiotico non è raccomandato anche se l’azitromicina potrebbe essere utile per i pazienti con linfoadenopatia grande e voluminosa. Per la presentazione atipica della CSD il trattamento antibiotico è necessario e una combinazione di doxiciclina e rifampicina è stata proposta per la neuroretinite e l’encefalopatia.

Durante la prima guerra mondiale, i soldati con la febbre di trincea hanno eliminato l’infezione in assenza di trattamento antibiotico. Tuttavia, il trattamento di successo di alcuni pazienti con febbre da trincea con tetraciclina o cloramfenicolo è stato riportato dopo la seconda guerra mondiale, anche se questi dati rimangono aneddotici. Uno studio clinico randomizzato di Foucault et al. ha riportato che i senzatetto con episodi di batteriemia da B. quintana dovrebbero essere trattati con una combinazione di gentamicina e doxiciclina. I risultati hanno mostrato l’eradicazione della batteriemia in sette su nove pazienti trattati rispetto a due su 11 controlli non trattati. I pazienti con batteriemia acuta di B. quintana potrebbero essere trattati con gentamicina in combinazione con doxiciclina per 28 giorni.

Il trattamento dell’endocardite da Bartonella è critico poiché il tasso di mortalità e la chirurgia valvolare sono più alti in questi pazienti. Raoult et al. hanno riferito che il tasso di recupero dei pazienti era più alto quando gli aminoglicosidi erano usati in combinazione con β-lattamici o con altri antibiotici. Quindi, la raccomandazione per i pazienti con endocardite da Bartonella è doxiciclina per 6 settimane più gentamicina per 14 giorni.

L’angiomatosi biliare e la PH devono essere trattate con eritromicina per 3-4 mesi come trattamento antibiotico di prima linea. Anche se l’eritromicina ha un’attività antibiotica contro Bartonella, è stato dimostrato che l’eritromicina ha anche un effetto anti-angiogenico sulle cellule endoteliali che può contribuire alla sua buona attività in vivo. La doxiciclina può essere utilizzata come regime alternativo. La durata del trattamento con eritromicina è critica (3 mesi per l’angiomatosi bacillare e 4 mesi per la PH) per limitare le ricadute.

Penicillina G, cloramfenicolo, tetraciclina, streptomicina ed eritromicina sono stati usati per il trattamento della febbre di Oroya, che è causata da B. bacilliformis. I fluorochinoloni sono stati usati con successo per il trattamento della febbre di Oroya, ma non ne raccomandiamo l’uso da solo, poiché esiste un basso livello intrinseco di resistenza ai fluorochinoloni nel genere Bartonella a causa di una mutazione intrinseca nella girasi del DNA. Come trattamento alternativo, si potrebbe usare il cloramfenicolo da solo o in combinazione con un β-lattamico o la ciprofloxacina.

Dal 1975, la rifampicina è diventata il farmaco di scelta per il trattamento della verruga peruana. Tuttavia, è stato riportato anche il fallimento del trattamento con rifampicina, che potrebbe essere dovuto a ceppi resistenti che si ottengono facilmente in vitro. In uno dei nostri studi recenti, abbiamo raccomandato la doxiciclina combinata con la gentamicina come regime preferito per il trattamento della fase cronica della malattia di Carrion.