PMC

Questa conferenza è basata su una recente revisione.

L’onere crescente del diabete in tutto il mondo è ben noto, e gli effetti sui costi dell’assistenza sanitaria e sulla sofferenza umana, la morbilità e la mortalità si faranno sentire soprattutto nelle nazioni in via di sviluppo, tra cui India, Cina e paesi africani. Nuovi farmaci vengono sviluppati ad un ritmo rapido, e gli ultimi anni hanno visto diverse nuove classi di composti per il trattamento del diabete, ad esempio i mimetici del peptide simile al glucagone (GLP-1), gli inibitori della dipeptidil-peptidasi-4 (DPP-4), gli inibitori del trasportatore di glucosio-2 (SGLT2). Anche i nuovi trattamenti chirurgici sono diventati sempre più disponibili e sostenuti come terapie efficaci per il diabete. La chirurgia di restrizione gastrica, la chirurgia di bypass gastrico, il trapianto simultaneo di pancreas e reni, il trapianto di pancreas e di isole sono stati tutti introdotti negli ultimi anni. Per evitare il trauma di una grande operazione, ci sono stati molti studi sul trapianto di isole isolate rimosse da un pancreas cadaverico. C’è stato un incoraggiamento dal “protocollo di Edmonton” descritto da Shapiro e colleghi nel New England Journal nel 2000. Le isole venivano iniettate nella vena porta e i pazienti, specialmente quelli che soffrivano di una pericolosa inconsapevolezza ipoglicemica, venivano trattati prima che avessero sviluppato gravi complicazioni del diabete, specialmente quelle renali. Mentre i primi risultati erano promettenti, con circa il 70% dei pazienti che non richiedevano iniezioni di insulina dopo due anni, a cinque anni, la maggior parte di questi pazienti era peggiorata e richiedeva integratori di insulina, nonostante alcuni avessero ricevuto più di un trapianto di isole. Nelle serie più recenti di pazienti, il gruppo di Edmonton ha riportato migliori risultati a lungo termine con l’uso dell’anticorpo monoclonale anti-linfociti, Campath 1H dato come agente di induzione, il 45% dei pazienti era insulino-indipendente a cinque anni, e il 75% aveva C-peptide rilevabile.

Tuttavia, i pancreati cadavarici e le isole competono per la stessa fonte e sono limitati in numero, e quindi, nessuno dei due trattamenti potrebbe essere facilmente offerto alla stragrande maggioranza dei pazienti diabetici. Alcuni hanno tentato di utilizzare una fonte alternativa, per esempio, isolotti incapsulati da maiali neonatali o adulti. Questo è ancora molto sperimentale e sarà un’alternativa lontana con molti ostacoli tecnici e forse etici da superare.

Più recentemente, con i successi nello sviluppo di cellule staminali adulte pluripotenti (da Yamanaka, premiato con il Nobel 2012 per la medicina per lo sviluppo di cellule staminali pluripotenti indotte – iPSCs), sono stati tentati nuovi approcci per cercare un metodo che possa essere più accessibile e disponibile. Molte speranze sono derivate inizialmente dalla ricerca sulle cellule staminali embrionali (ESC), poiché queste cellule possono essere convinte a moltiplicarsi e svilupparsi in qualsiasi tessuto, ma il processo era costoso, e il problema della formazione di teratomi da queste cellule staminali si è rivelato estremamente difficile da superare. Molti dei fattori importanti legati allo sviluppo fetale non sono compresi e non possono essere riprodotti. Tuttavia, alcuni progressi sono stati fatti, e (occasionalmente) le cellule sono state persuase a secernere insulina, ma finora, le applicazioni terapeutiche sono state minime.

Gli scienziati sono ora consapevoli che convincere una cellula a produrre insulina è solo un passo di quello che può essere un viaggio lungo e difficile. Le cellule delle isole sono altamente specializzate per avere non solo un rilascio basale di insulina, ma anche per rispondere rapidamente ai cambiamenti nella concentrazione di glucosio nel sangue. Con l’insulina, il processo e la regolazione dello spegnimento della secrezione sono importanti quanto l’accensione della secrezione.

Sono stati fatti diversi approcci con diversi punti di partenza. La cellula staminale si riproduce e può anche dividersi asimmetricamente e formare un altro tipo di cellula: Questo è noto come differenziazione. Anche se inizialmente si pensava che fossero disponibili solo dagli embrioni, le cellule staminali non embrionali possono ora essere ottenute senza troppe difficoltà dal tessuto neonatale, dal cordone ombelicale e anche da una varietà di tessuti adulti tra cui il midollo osseo, la pelle e il grasso. Queste cellule staminali possono essere espanse e fatte differenziare, ma il loro repertorio è limitato rispetto alle cellule staminali embrionali: oligo- o pluri- rispetto alle cellule staminali embrionali toti-potenti. Inoltre, recentemente, c’è stato molto interesse nel processo di trans-differenziazione cellulare diretta, in cui una cellula impegnata e completamente differenziata, per esempio una cellula epatica, viene trasformata direttamente in un altro tipo di cellula, per esempio una beta-cellula dell’isolotto, senza induzione di de-differenziazione fino allo stadio di cellula staminale.

Yamanaka, nel 2006, è stato in grado di produrre cellule staminali pluripotenti da culture di fibroblasti neonatali e adulti di topo aggiungendo un cocktail di quattro fattori definiti. Questo ha portato a una serie di altri studi che hanno sviluppato il processo, che si è dimostrato ripetibile sia con tessuti umani che con topi di laboratorio. L’uso delle cellule iPS ha evitato i vincoli etici dell’uso di embrioni umani, ma ci sono stati ancora altri problemi e ostacoli. Ci sono stati rapporti emergenti di cellule iPS che diventano antigeniche per un ospite autologo o isologo, e le cellule possono accumulare anomalie del DNA e anche mantenere la memoria epigenetica del tipo di cellula di origine e quindi hanno una tendenza a tornare indietro. Come le cellule staminali embrionali, le cellule iPS possono formare teratomi, soprattutto se la differenziazione non è completa.

Nonostante questo, c’è stato molto poco successo nel dirigere la differenziazione delle iPSC per formare cellule beta delle isole in quantità sufficiente che secerneranno e fermeranno la secrezione in risposta ai cambiamenti dei livelli di glucosio nel sangue.

Un altro approccio che è stato provato è quello di combinare la terapia genica con le cellule staminali. Sono stati fatti alcuni progressi nel tentativo di esprimere il gene dell’insulina desiderato in cellule indifferenziate più primitive, convincendo le cellule staminali con fattori di differenziazione in vitro e poi con una trasfezione genica diretta usando plasmidi o un vettore virale. Noi, e altri, abbiamo usato un costrutto di gene dell’insulina umana e introdotto ex vivo o in vivo nelle cellule per elettroporazione diretta (in cellule ex vivo ovviamente) o tramite vettori virali. L’adenovirus, il virus adeno-associato e vari retrovirus sono stati più studiati, specialmente il Lentivirus. Tuttavia, qualsiasi tipo di ingegneria genetica fa temere non solo l’infezione da parte del virus, ma anche lo smascheramento di onco-geni, che porta alla malignità, e ci sono regole severe su come procedere per evitare questi rischi.

Ci siamo interessati alle cellule staminali del cordone ombelicale e alle cellule staminali mesenchimali come target per la terapia combinata di cellule staminali e genica. Queste cellule possono essere ottenute in modo ragionevolmente facile e riproducibile dal cordone ombelicale altrimenti scartato, o dal midollo osseo facilmente accessibile, selezionando le cellule con varie tecniche standard. Anche il grasso, l’amnios e il sangue del cordone ombelicale sono fonti da cui si possono ricavare cellule staminali mesnecimali. Dopo una fase proliferativa, le cellule assumono un aspetto simile a un tappeto di fibroblasti, che possono differenziarsi in cellule ossee, cartilaginee o di grasso. Anche se le cellule staminali mesenchimali provenienti dalle varie fonti menzionate possono sembrare simili, i loro potenziali di differenziazione sono idiosincratici e diversi, il che rende inappropriato e difficile pensare a loro come una fonte uniforme di cellule bersaglio. Le cellule dell’amnion neonatale e le cellule del cordone ombelicale hanno una bassa immunogenicità e non esprimono antigeni HLA di classe II. Secernono anche fattori che inibiscono le reazioni immunitarie, per esempio, HLA-G solubile. Anche se l’immunogenicità è ridotta significativamente, non sono ancora autologhe e, quindi, rimane un rischio di rigetto dell’allotrapianto. Hanno il vantaggio di poter essere moltiplicate, congelate e conservate in grandi quantità e potrebbero essere usate in pazienti che hanno già bisogno di agenti immunosoppressivi, per esempio quelli che hanno un trapianto renale.

A Singapore, i nostri studi sulle cellule amnioidi derivate dal cordone ombelicale hanno mostrato un certo successo nell’avere l’espressione dei geni dell’insulina e del glucagone, ma poca o nessuna secrezione di insulina in vitro. Insieme alla trasfezione del gene dell’insulina in vitro, dopo il trapianto peritoneale in topi diabetici indotti da sterptozotocina, c’è stato un certo miglioramento dei livelli di glucosio. I nostri colleghi di Singapore hanno usato un altro modello di epatociti autologhi da maiali diabetici indotti da streptozotocina. Questi epatociti separati sono stati trasfettati con successo ex-vivo con un costrutto di gene dell’insulina umana mediante elettroforesi, e poi le cellule sono state iniettate direttamente nel parenchima epatico mediante iniezioni multiple separate. I maiali sono stati curati dal loro diabete fino a nove mesi – che è un risultato notevole. Trattandosi di autotrapianti, non sono stati necessari farmaci immunosoppressori, ma le cellule epatiche sono state ottenute da grandi biopsie chirurgiche aperte. Questa necessità di rimozione chirurgica del tessuto epatico limiterebbe la sua applicabilità, ma tuttavia è stato un buon studio di prova del concetto. Nel contesto del diabete autoimmune, il rischio di malattia ricorrente può persistere a meno che il bersaglio dell’attacco autoimmune possa essere definito ed eliminato. In questi esperimenti suini, è stato utilizzato il gene dell’insulina umana con un promotore sensibile al glucosio EGR-1. Non c’era nessun virus coinvolto, e il plasmide non si integra. La divisione della cellula trasfettata diluirebbe l’attività del gene, ma un gran numero di plasmidi può essere prodotto a basso costo. Lo stesso gruppo di lavoratori ha trasfettato con successo cellule staminali mesenchimali del midollo osseo con il plasmide del gene dell’insulina umana usando lo stesso promotore EGR-1 e l’elettroforesi. Questo ha curato topi diabetici dopo iniezione diretta intra-epatica e intra-peritoneale.

Finalmente, ci dovrebbe essere cautela nell’interpretare i risultati di questi e altri rapporti di terapia cellulare e genica per il diabete. In gene transfection and/or transplantation of insulin-producing cells or clusters in the diabetic rodent, there have been many reports in the literature, but only a few of these claims have been reproduced in independent laboratories. We have suggested the need to satisfy “The Seven Pillars of Credibility” as essential criteria in the evaluation of claims of success in the use of stem cell and/or gene therapy for diabetes.

1. Cure of hyperglycemia

2. Response to glucose tolerance test

3. Evidence of appropriate C-peptide secretion

4. Weight gain

5. Prompt return of diabetes when the transfecting gene and/or insulin producing cells are removed

6. No islet regeneration of stereptozotocin-treated animals and no re-generation of pancreas in pancreatectomized animals

7. Presence of insulin storage granules in the treated cells