Role of Candida in Antibiotic-Associated Diarrhea
Abstract
Per valutare quantitativamente il ruolo delle specie di Candida nella diarrea associata agli antibiotici (AAD), campioni di feci da un totale di 395 pazienti e soggetti di controllo sono stati coltivati in un terreno di isolamento differenziale: 98 pazienti avevano AAD, 93 pazienti prendevano antibiotici ma non avevano diarrea (A+D-), 97 pazienti non prendevano antibiotici ma avevano diarrea (A-D+), e 107 pazienti erano soggetti di controllo (A-D-). Inoltre, è stata testata la produzione di proteinasi aspartilica secreta (Sap). Nei pazienti AAD, la positività alla Candida (77/98) e la crescita eccessiva della Candida (62/98) non erano diverse da quelle dei pazienti A+D- (75/93 e 52/93, rispettivamente). La sovracrescita della Candida tra i pazienti A-D+ (40/97, P=.003) era meno frequente che tra i pazienti AAD, ma la positività alla Candida non era diversa (80/97, P=.612). Nei soggetti di controllo, la positività alla Candida e la crescita eccessiva erano meno comuni che in tutti gli altri gruppi. La produzione di Sap non differiva tra i pazienti con DAA e i soggetti di controllo (P=.568 e P=.590, rispettivamente). I dati indicano che i conteggi elevati di Candida sono un risultato del trattamento antibiotico o della diarrea piuttosto che una causa della DAA
Il mughetto orale e l’esofagite sono le manifestazioni patologiche più comuni delle infezioni da Candida. Il ruolo della Candida nella diarrea associata agli antibiotici (DAA) è stato discusso. Concentrazioni fecali di specie di Candida di ⩾105 ufc/mL di feci sono state considerate causa di diarrea nei pazienti dopo la terapia antibiotica. È stato riportato che i pazienti che hanno ricevuto antibiotici senza sviluppare diarrea avevano <105 cfu funghi Candida/mL di feci
Le proteinasi aspartiliche secrete (Saps) sono importanti fattori di virulenza prodotti dalle specie Candida. Le Saps sono coinvolte nell’adesione della Candida albicans alla mucosa umana e nell’invasione dei tessuti umani. Una correlazione tra l’espressione di Saps e la virulenza della Candida è stata dimostrata nella candidosi orale e nella vaginite da Candida in pazienti infettati dal virus dell’immunodeficienza umana (HIV). Nella DAA legata alla Candida, la secrezione attiva mediata da una tossina fungina o da sostanze simili alle tossine è stata discussa come meccanismo patogenetico della diarrea. In C. albicans sono stati identificati 10 diversi geni SAP. In Candida tropicalis è stata osservata una debole attività proteolitica extracellulare, mentre Candida glabrata non ha attività proteolitica su agar proteico
C. albicans è nota per produrre proteasi aspartiliche quando cresce in un terreno con proteine come unica fonte di azoto, e l’espressione del gene SAP2 è principalmente responsabile dell’attività proteolitica osservata nella maggior parte dei ceppi che crescono in forma di lievito in vitro. Saps mostra anche attività proteolitica nel tratto gastrointestinale; è stata dimostrata l’espressione di SAP nella candidosi orale e la degradazione della mucina gastrointestinale da parte di Saps. La degradazione della mucina gastrointestinale da parte degli enzimi è stata implicata come un determinante di virulenza per un certo numero di enteropatogeni (ad esempio, Vibrio cholerae, Shigella species, Helicobacter pylori e Yersinia enterocolitica). Per C. albicans che colonizza le superfici delle mucose, la degradazione della mucina da parte di SAP2 può consentire un maggiore avvicinamento alle cellule epiteliali e/o la modifica delle superfici cellulari. Livelli più elevati di proteinasi acida Candida secretoria sono stati trovati nei bambini con diarrea acuta e cronica rispetto ai soggetti sani di controllo
Per chiarire la rilevanza patogenetica delle specie di Candida nei pazienti adulti con DAA, abbiamo eseguito colture quantitative delle feci per le specie di Candida in 395 adulti immunocompetenti. Inoltre, è stata esaminata la produzione di Saps
Metodi
Selezione dei pazienti e raccolta di campioni di feciTutti i pazienti di un reparto medico di 250 letti sono stati esaminati per diarrea o per trattamento antibiotico in assenza di diarrea su una base quotidiana per 11 mesi. La diarrea era definita come >3 feci molli o acquose al giorno. Il trattamento antibiotico è stato definito come la ricezione di antibiotici per via orale o endovenosa in dosi terapeutiche per ⩾1 giorno. La DAA è stata definita come >3 feci molli o acquose al giorno durante o fino a 2 mesi dopo il trattamento antibiotico. I pazienti sono stati reclutati consecutivamente in 4 gruppi di studio fino al raggiungimento del numero predeterminato necessario per il confronto statistico (vedi analisi statistica di seguito). I pazienti sono stati inclusi solo una volta durante il loro ricovero in ospedale
I campioni di feci di tutti i pazienti con diarrea sono stati messi in coltura per i patogeni batterici (salmonella, shigella, yersinia e campylobacter) su agar selettivo, sono stati esaminati per ovuli e parassiti e sono stati testati per Clostridium difficile mediante coltura su agar selettivo e mediante l’uso del test rapido C. difficile (BD). I pazienti con uno qualsiasi di questi patogeni sono stati esclusi dallo studio. Così, 395 pazienti (195 con diarrea e 200 senza) sono stati inclusi nello studio e sono stati assegnati a 4 gruppi: (1) gruppo A+D+, 98 pazienti affetti da DAA che ricevevano antibiotici e presentavano diarrea; (2) gruppo A+D-, 93 pazienti che ricevevano antibiotici ma non presentavano diarrea; (3) gruppo A-D+, 97 pazienti che non ricevevano antibiotici ma presentavano diarrea; e (4) gruppo A-D-, 107 soggetti di controllo che non ricevevano antibiotici e non presentavano diarrea
I 4 gruppi non differivano per sesso ed età. I campioni di feci di tutti i soggetti sono stati raccolti immediatamente dopo un movimento intestinale e sono stati portati al laboratorio nello stesso edificio entro 15 minuti. I campioni di feci passate durante la notte sono stati conservati a 4°C e sono stati processati la mattina successiva
Colture di candida e strisci di vetriniI campioni di feci sono stati diluiti 1:10 con soluzione salina, sono stati agitati in un omogeneizzatore di feci, e nuovamente diluiti 1:1000 e 1:10000 con soluzione salina. Cento microlitri di ogni diluizione sono stati trasferiti su un Candida CHROMagar (BBL) e sono stati piastrati uniformemente con un tampone sterile. Dopo l’incubazione a 37°C per 48 ore in aria ambiente, le colonie di Candida sono state contate e classificate come C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis o altre specie di Candida, secondo il colore delle colonie. Una conta di colonie ⩾105 ufc/mL di feci è stata classificata come “crescita eccessiva di Candida”, secondo Danna et al. Uno striscio di vetrino di ogni diluizione dei primi 100 campioni consecutivi di feci è stato colorato con la colorazione di Gram ed è stato esaminato al microscopio ottico per la presenza di lieviti e leucociti
Rilevazione di SapsConsecutivi isolati di Candida dai gruppi di pazienti A-D- e A+D+ sono stati testati per la secrezione di proteinasi aspartiliche in agar di albumina di siero bovino (BSA) (1,17% di lievito base carbonica, 0,01% di estratto di lievito e 0,2% BSA), come descritto altrove. Il mezzo è stato regolato a pH 5.0, è stato sterilizzato per filtrazione (dimensione dei pori, 0.2 μm), ed è stato aggiunto a una soluzione stock di agar autoclavato (2%). La proteolisi, che indica l’attività enzimatica, è stata misurata in millimetri ed è stata valutata come suggerito altrove: – o ± (nessun visibile o una chiarificazione molto limitata dell’agar intorno alla colonia era presente), 1+ (apprezzabile proteolisi è stata osservata), e 2+ (chiarificazione agar ampiamente superato il margine della colonia). Il ceppo C. albicans SC5314 e un mutante SAP2 nullo (fornito da B. Hube, Università di Amburgo, Germania) sono stati studiati come controlli
Analisi statisticaIl numero di pazienti con diversi conteggi di Candida in diversi gruppi sono stati confrontati con il test del χ2, e i conteggi di lievito su strisci di vetrino sono stati correlati ai conteggi di Candida dalle colture con l’uso della correlazione di Pearson. Le differenze nella produzione di linfa sono state calcolate con il test t di Student e il test esatto di Fisher. La dimensione del campione per l’esame colturale è stata calcolata come 91 pazienti valutabili, e per il test della linfa è stata calcolata come 20 pazienti valutabili per gruppo, con un α di .05 e una potenza di 0,8 (SigmaStat, versione 2.0; Jandel Scientific). Le differenze con P<.05 sono state considerate significative
Risultati
Culture di Candida e strisci di vetrinoI risultati delle colture di Candida sono mostrati nella figura 1. Nel gruppo A+D+, la positività alla Candida (in 77/98 pazienti) e la sovracrescita della Candida (in 62/98 pazienti) non erano significativamente diverse da quelle del gruppo A+D- (75/93 pazienti e 52/93 pazienti, rispettivamente). Nel gruppo A-D+, la sovracrescita della Candida era significativamente meno frequente che nel gruppo A+D+ (P=.003), ma la positività alla Candida non era significativamente diversa (P=.612). La positività alla Candida e la crescita eccessiva erano significativamente meno comuni nel gruppo A-D- rispetto a tutti gli altri gruppi (positività alla Candida: 66/107 pazienti, P=.013, rispetto al gruppo A+D+; P=.005, rispetto al gruppo A+D-; e P=.002, rispetto al gruppo A-D+; crescita eccessiva della Candida: 15/107 pazienti, P<.001, rispetto a tutti gli altri gruppi; figura 1)
Risultati della conta della Candida nei campioni di feci dei diversi gruppi di studio: gruppo A+D+, pazienti con diarrea associata ad antibiotici che ricevevano antibiotici e avevano diarrea; gruppo A+D-, pazienti che ricevevano antibiotici ma non avevano diarrea; gruppo A-D+, pazienti che non ricevevano antibiotici ma avevano diarrea; e gruppo A-D-, pazienti di controllo che non ricevevano antibiotici e non avevano diarrea. Le barre dell’istogramma (asse Y sinistro) mostrano i risultati delle colture negative (bianco) e le colture con specie di Candida, a livelli ⩾105 ufc/mL feci (nero) e <105 ufc/mL feci (grigio). I dot plot (asse Y destro) accanto a ciascuna delle barre dell’istogramma mostrano la distribuzione di frequenza degli ufc/mL
Risultati della conta di Candida nei campioni di feci di diversi gruppi di studio: gruppo A+D+, pazienti con diarrea associata ad antibiotici che ricevevano antibiotici e avevano diarrea; gruppo A+D-, pazienti che ricevevano antibiotici ma non avevano diarrea; gruppo A-D+, pazienti che non ricevevano antibiotici ma avevano diarrea; e gruppo A-D-, pazienti di controllo che non ricevevano antibiotici e non avevano diarrea. Le barre dell’istogramma (asse Y sinistro) mostrano i risultati delle colture negative (bianco) e le colture con specie di Candida, a livelli ⩾105 cfu/mL feci (nero) e <105 cfu/mL feci (grigio). I diagrammi a punti (asse Y destro) accanto a ciascuna delle barre dell’istogramma mostrano la distribuzione di frequenza degli ufc/mL
Le analisi esplorative che utilizzano diversi cutoff per la definizione della crescita eccessiva di Candida (103, 104, 106, o 107 ufc/mL di feci) hanno dato risultati qualitativamente simili. In tutti i calcoli, la sovracrescita di Candida era significativamente meno comune nel gruppo A-D- che in tutti gli altri gruppi. C. albicans era l’isolato più frequente (216 di 395 pazienti) seguito da C. glabrata (104 di 395 pazienti), C. tropicalis (21 di 395 pazienti), C. krusei (11 di 395 pazienti), e altre specie di Candida (97 di 395 pazienti). Colture miste di Candida sono state trovate in 122 (31%) dei 395 pazienti. I conteggi dei lieviti sugli strisci dei vetrini non erano correlati ai conteggi delle colture (r=.27; figura 2)
Correlazione dei conteggi dei lieviti sugli strisci dei vetrini e delle colture di Candida (r=.27, correlazione di Pearson)
Correlazione della conta dei lieviti su strisci di vetrino e colture di Candida (r=.27, correlazione di Pearson)
Risultati dell’attività proteolitica su agar BSAIn totale, 23 A+D+ e 20 A-D-Candida isolati sono stati testati per l’attività proteolitica in agar BSA. L’attività media±SD era 1,26±1,06 mm per il gruppo A+D+ e 1,42±0,64 mm per il gruppo A-D-. Dei 23 isolati A+D+, 16 avevano un punteggio di proteolisi di 1+ (zona di chiarificazione di 1-2 mm) e 1 aveva un punteggio di 2+ (zona di chiarificazione di 3-5 mm), entrambi indicanti la presenza di attività enzimatica delle proteinasi. Dei 20 isolati A-D-, 17 avevano un punteggio di proteolisi di 1+ e 2 avevano un punteggio di 2+. Tutti gli isolati di C. albicans hanno mostrato zone di chiarificazione sul terreno BSA (⩾1 mm, punteggio ⩾1+). Nel gruppo A-D-, 1 isolato di C. tropicalis non ha mostrato proteolisi. Nel gruppo A+D+, 5 isolati di C. glabrata e 1 isolato di C. tropicalis non hanno mostrato proteolisi. Le zone di chiarificazione dei gruppi A-D- e A+D+ non erano significativamente diverse quando misurate in millimetri (P=.568, test t di Student) o con il sistema di punteggio 1+/2+ (P=.294 e P=.590 per gli isolati con punteggio 1+ e 2+, rispettivamente, test esatto di Fisher). Quando gli isolati di C. glabrata (che sono noti per essere negativi su agar proteico) sono stati eliminati, non c’è stata alcuna differenza significativa nella produzione di Sap tra i gruppi (P=.347)
Discussione
La crescita eccessiva di Candida è stata postulata come causa di DAA. Abbiamo studiato la presenza e la quantità di specie di Candida in pazienti sospettati di avere la DAA, pazienti senza diarrea ma che prendono antibiotici, pazienti con diarrea ma che non prendono antibiotici e pazienti senza diarrea e che non prendono antibiotici (soggetti di controllo). Una proporzione significativamente più alta di campioni di feci di pazienti che ricevono una terapia antimicrobica e che soffrono di diarrea (gruppo A+D+) era positiva per le specie di Candida e aveva un numero di colonie più alto rispetto ai campioni dei soggetti di controllo (gruppo A-D-). In uno studio di Danna et al. , la crescita eccessiva di Candida (⩾105 ufc/mL di feci) è stata osservata in 7 (29%) di 24 pazienti con DAA. In quello studio, 0 dei 24 pazienti senza diarrea ma che ricevevano antibiotici avevano una crescita eccessiva di Candida. Tuttavia, nel nostro studio, 52 (56%) di 93 pazienti con antibiotici ma senza diarrea avevano una crescita eccessiva di Candida, e nessuna differenza è stata vista, rispetto ai pazienti AAD. Poiché abbiamo studiato un numero di pazienti quasi quadruplo (93 contro 24), le differenze tra i nostri risultati e quelli di Danna et al. possono essere dovuti alla dimensione del campione più grande nel nostro studio
Per valutare l’influenza della diarrea sulla conta intestinale della Candida, abbiamo anche studiato i pazienti che non ricevevano una terapia antibiotica ma che avevano diarrea (gruppo A-D+). In questo gruppo, la crescita eccessiva di Candida (⩾105 ufc/mL di feci) era significativamente meno frequente che nei pazienti AAD, ma la positività alla Candida non era significativamente diversa. Studi precedenti hanno dimostrato che la normale flora delle feci era marcatamente diminuita nei pazienti affetti da DAA. Negli studi in cui sono stati studiati gli effetti degli antibiotici ad ampio spettro sulla composizione della microflora intestinale dell’uomo, è stata osservata una significativa correlazione inversa tra il log del massimo aumento dei lieviti e il log della massima diminuzione degli anaerobi. Poiché abbiamo trovato un aumento della positività alla Candida nei pazienti AAD, nei pazienti A+D- e nei pazienti A-D+, suggeriamo che la diminuzione dei batteri nelle feci, dovuta o alla terapia antibiotica o alla diluizione nella diarrea, ha permesso alle specie di Candida di espandersi, con conseguente aumento della positività alla Candida
Nel nostro studio, la conta media dei lieviti sugli strisci colorati con la macchia di Gram non è correlata con le colture di Candida quando calcolata sia con il numero totale di lieviti sugli strisci dei vetrini (r=.27) o con l’indice suggerito da Danna et al. (r=.12). La discrepanza tra un gran numero di cellule simili al lievito contate al microscopio ottico e la scarsa o assente crescita delle specie di Candida è stata riportata altrove 15]. In quello studio, gli autori presumevano che una grande maggioranza dei lieviti nelle feci rilevate al microscopio non fossero vivi. I nostri risultati hanno indicato che grande cautela dovrebbe essere esercitata nell’interpretare i campioni di feci di pazienti con DAA e positivi per le specie di Candida. L’utilità di analizzare le feci per la conta della Candida tramite coltura o strisci di vetrino in questi pazienti è seriamente messa in dubbio. L’assenza di leucociti nei campioni colorati con la macchia di Gram era coerente con i risultati precedenti. I nostri risultati hanno anche confermato che le specie di Candida facevano parte della normale flora intestinale
La secrezione attiva mediata da una tossina fungina o da sostanze simili alle tossine è stata discussa come il meccanismo della DAA legata alla Candida. Poiché le SAP sono i principali fattori di virulenza nelle infezioni da Candida, abbiamo studiato queste proteinasi in vitro. Ad oggi, 10 diversi geni SAP sono stati identificati in C. albicans. Poiché la SAP è stata segnalata per contribuire al danno tissutale in un modello di candidosi orale umana, queste proteinasi possono anche danneggiare le cellule epiteliali intestinali. Ma in 8 pazienti sospettati di avere la DAA legata alla Candida, non c’era alcuna prova di colite o di danno cellulare
Nel nostro studio, tutti i ceppi di C. albicans indagati hanno prodotto Sap, e non c’era alcuna differenza significativa tra la quantità di Sap prodotta in isolati di Candida da pazienti con DAA e soggetti di controllo. Livelli più elevati di proteinasi acide secretorie della Candida sono stati trovati nei bambini con diarrea acuta e cronica rispetto ai soggetti sani di controllo. Anche se i livelli di Sap calcolati per l’intero gruppo di bambini con diarrea acuta o cronica erano significativamente più alti dei livelli nei soggetti di controllo, questo non era il caso nei singoli casi. Di 9 isolati di Candida, 4 dei soggetti di controllo (bambini senza diarrea) avevano livelli di Sap comparabili a quelli dei bambini con diarrea cronica, e 2 dei 9 soggetti di controllo avevano livelli comparabili a quelli dei bambini con diarrea acuta. Nonostante questi alti livelli di Sap, i soggetti di controllo non avevano diarrea. Questo contrasta con i risultati di studi precedenti, in cui la produzione di Sap nei pazienti sintomatici ha sempre raggiunto livelli più alti che nei soggetti di controllo: La produzione di linfa da parte di specie di Candida provenienti da pazienti affetti da vaginite ha sempre superato la produzione di linfa da parte di Candida proveniente da portatori, e i ceppi di Candida provenienti da candidosi orale in pazienti affetti da AIDS hanno prodotto una quantità di linfa ∼8 volte maggiore rispetto agli isolati provenienti da soggetti di controllo
La produzione di linfa è coerentemente indicata dal BSA agar test e dall’ELISA . Inoltre, alti livelli di Sap secreti in vitro e rilevati dal BSA agar o dall’ELISA erano correlati a livelli aumentati di Sap in vivo (ad esempio, nei fluidi vaginali di pazienti con vaginite HIV-positiva). Si può ipotizzare che la specie Candida produca temporaneamente alti livelli di Sap in vivo ma perda questa capacità a causa, per esempio, della subcoltura. In C. albicans isolata dalle cavità orali, è stato dimostrato che la produzione elevata di Sap era una caratteristica stabile. D’altra parte, gli isolati di C. albicans con bassa produzione di proteinasi hanno mostrato una produzione di Sap stabile e di basso livello su subcolture ripetute
In sintesi, i risultati del nostro studio non confermano i meccanismi patogenetici precedentemente suggeriti della DAA legata alla Candida. I nostri dati indicano che i conteggi elevati di Candida sono un risultato del trattamento antibiotico o della diarrea di per sé piuttosto che una causa di DAA. La produzione del principale fattore di virulenza fungina Sap nei pazienti con DAA non differisce da quella nei soggetti di controllo, il che indica che questa tossina fungina non può essere responsabile della DAA negli adulti. Altri fattori di virulenza fungina (ad esempio phospholipases) warrant further investigation
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Presented in part: Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Toronto, Canada, 2000 (poster category J, no. 221)
This study was approved by the ethics committee of Karl-Franzens University, Graz
Financial support: Österreichische Nationalbank; Austrian Society of Infectious Diseases