ディスク拡散法とEtest法を用いたlinezolidのスペクトラムと活性の多施設評価：Zyvox® Antimicrobial Potency Study in Latin America（LA-ZAPS）の報告
ディスク拡散法とEtest法を用いたlinezolidのスペクトラムと活性の多施設評価：Zyvox® Antimicrobial Potency Study in Latin America（LA-ZAPS）
LA-ZAPS Study Group； Charles H…. Ballow; Douglas J. Biedenbach; Flavia Rossi and Ronald N. Jones
The Buffalo Clinical Research Center, Buffalo, NY, USA
The Jones Group/JMI
Laboratories, North Liberty, IA, USA
Institute de Infectologia E. Ribas, Sao Paulo, Brazil
and the Tufts University School of Medicine, Boston, Massachusetts, MA, USA
Address to correspondence
Linezolidは「oxazolidinones」という新しい抗菌クラスの中で最初に臨床的に応用されたメンバーでした。 オキサゾリジノン系抗菌薬は，他の抗菌薬に耐性を持つ株を含むグラム陽性菌に対して，強力な抗菌スペクトルを有している。 我々は，中南米8ヵ国24施設の医療機関から分離されたグラム陽性菌に対する多施設共同試験（Zyvox Antimicrobial Potency Study；ZAPS）を実施した。 2,640株を標準ディスク拡散法（AB BIODISK, Solna, Sweden）により試験し，linezolidの活性およびスペクトラムを，グリコペプチド系，キヌプリスチン／ダルフォプリスチン，βラクタム系，フルオロキノロンなど多くの薬剤と比較検討した。 ブドウ球菌に対するlinezolidのスペクトラムは，vancomycinおよびquinupristin/dalfopristinのスペクトラムと同様に完全であった（ゾーン径中央値，29～32 mm）。 腸球菌では，linezolid耐性菌は検出されず，感受性率は93.1～96.4％であった。 Enterococcus faeciumでは，vancomycin感受性株のみがキヌプリスチン/ダルフォプリシンに92.8％の感受性を有していた。 VRE 22株では，糖ペプチド耐性パターン（van Aとvan B）に顕著な差異が認められ，治療方針を決定するためには，局所的な感受性試験が必要と考えられた。 Streptococcus pneumoniaeおよびその他の菌種はlinezolidに100.0％（MIC90：0.75 mg/ml）の高感受性を示した。 ペニシリン非感受性率は27.7％，エリスロマイシン耐性率は17.4％であった。 その他の連鎖球菌もlinezolidに完全感受性（MIC90，1 mg/ml）であった。 以上の成績は，ラテンアメリカの医療施設におけるlinezolidの有効性とスペクトラムの最初の指標となるものである。 今後，2000年から2001年に分離されたブドウ球菌，腸球菌，連鎖球菌に対して，oxazolidinone系抗菌薬は基本的に完全なスペクトラムを有していることを認識する必要がある。 このことから，linezolidは多剤耐性グラム陽性球菌に対して最も広いスペクトルを有する経験的選択肢であり，既存のグリコペプチドやストレプトグラミン配合剤よりも優れた活性スペクトルを有していると考えられた。
Key Words:
グラム陽性菌の耐性化が世界的に進んでいることから、ペニシリン系、マクロライド系、グリコペプチド系に代わる薬剤の早期発見・開発が必要となっています。 新しいクラスの薬剤としては、ストレプトグラミン、エバーニノミシン、そしてトロバフロキサシンのようなグラム陽性スペクトルを拡大したフルオロキノロン系抗菌薬が挙げられる。 しかし，いずれもバンコマイシンのような糖ペプチド系抗菌薬以上のスペクトルを有しておらず，化学療法中の耐性化が報告されている． 実際、キヌプリスチン／ダルフォプリスチンは腸球菌のうちEnterococcus faeciumのみを阻害し、ラテンアメリカではバンコマイシン耐性E. faecalisの風土病や流行があり、治療の選択肢は限られている … ブラジルや他のラテンアメリカ諸国では、新しい薬剤が実用化されるにつれて、これらの新しいクラスに対する耐性の出現を監視するために、ベースラインの感受性情報が不可欠になっています。
リネゾリドは、オキサゾリジノン系で初めて、問題のあるバンコマイシン耐性腸球菌 (VRE) 、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌 (MRSA) またはコアグラーゼ陰性ブドウ球菌 (MR-CoNS) 、薬剤耐性肺炎球菌 (DRSP) に広く使われるようになった薬剤となりました。 このクラスの初期の薬剤であるDuP105やDuP721は有望な効能を示したが、毒性によりヒトでの開発試験が進まなかった。 ファルマシア& アップジョンの科学者たちは、オキサゾリジノンの基本構造に変更を加え、安全な薬剤であるリネゾリド（PNU-またはU-100766）とエレゾリド（PNU-またはU-100692）を開発し、リネゾリは臨床開発に進出しています。 欧州および北米における市販前・市販後調査の結果、ブドウ球菌、腸球菌、連鎖球菌、その他多くのグラム陽性菌のすべてのネイティブ分離株に対して、リネゾリドによる基本的に完全阻害作用が証明されています。 また、優れた抗菌作用と明確な作用機序が報告されています。 多施設共同調査の1つであるZyvox Antimicrobial Potency Study（ZAPS）には、9カ国29施設の中南米医療施設におけるlinezolidの比較活性とスペクトラムをモニタリングするコンポーネントが含まれていました。 標準化された参照品質の方法を用いたこの対照試験の結果は、この新しいオキサゾリジノンに関する地域最大かつ地理的に多様な試験であると言えます。
材料と方法
参加者。 アルゼンチン、ブラジル、チリ、コロンビア、コスタリカ、グアテマラ、メキシコ、ペルー、ベネズエラの医療機関を含む9カ国、計29名のラテンアメリカ人医師が、この研究に分離株の結果を提供しました。 各施設は、ブドウ球菌、腸球菌、連鎖球菌のうち、定義された数の150の地元分離株を検査するよう依頼された。 このプロトコールデザインにより、各属群について多くの種が得られ、耐性表現型の比較により、かなりの数の評価可能な株が得られた。 定義されたスクリーニング耐性基準を満たす合計330株が、linezolid（£20 mm）、vancomycin（£14 mm）、quinupristin/dalfopristin（£18 mm）およびteicoplanin（£10 mm）のゾーン径値に基づいて地域コーディネーター（ブラジル、サンパウロ）から依頼された。 溶連菌のMIC紹介基準は，linezolid（> 4 mg/ml），trovafloxacin（> 1 mg/ml）およびquinupristin/dalfopristin（> 1 mg/ml）のfollowersと指定された。 これらの基準を満たした分離株のうち，地域コーディネーターが受理した生残株は202株で，67株が確認された． グリコペプチド耐性またはストレプトグラミン耐性を有する菌株のみが確認され、これらはさらなる特性解析のために国際微生物学コーディネーター（米国アイオワ州）へ転送された。
細菌分離株の収集。 リネゾリドと比較対象のグラム陽性・広域抗菌薬のスペクトラム活性を、合計2,640株の適格な細菌分離株に対して評価しました。 これらの菌株は，多種多様な患者感染症から臨床的に重要な菌株であり，プロトコールのガイドラインに従い，試験期間中（1999～2000年）は1患者あたり1株のみを対象とした。 検査対象は，黄色ブドウ球菌（50株），CoNS（35株），腸球菌（40株），連鎖球菌（25株）の3属群（合計150株/施設）とした。 収集されたデータは、地域コーディネーターと米国（アイオワ州およびニューヨーク州）の国際モニターに送られ、後者がすべてのデータセットを入力・処理した。 異常な感受性パターンが懸念される場合は、Vitek（bioMerieux, St.Louis, MO, USA）および／または生化学的検査を用いて種レベルの同定が行われた。
テストした生物のうち、黄色ブドウ球菌とCoNSの合計1,582株が研究に含まれ、そのうち586株と262株がそれぞれオキサシリンに感受性があった。 また，Oxacillin耐性菌はS. aureusで378株，CoNSで356株であった。 Enterococcus属菌は599株で，E. faecalis（496株）が最も多く，次いでE. faecium，特定不能の腸球菌であったが，vancomycin耐性株は22株のみ確認された。 残りの437株は，S. pneumoniae（339株），viridans group，b-Haemolytic streptococci などの連鎖球菌属であった。 肺炎球菌以外の菌株については，試験薬に対する感受性に有意な差が認められなかったため，解析のためにこの2つのグループを合算した。 また，S. aureus ATCC 25923，29213，E. faecalis ATCC 29212を含むATCCディスク拡散法およびMIC品質管理株による品質保証を実施した． これらのQC株は，試験方法（Etest法，Disk diffusion法）により，各試験抗菌薬で212の結果が得られた． QCの結果が多数異常であった施設（5施設）のデータは調査から除外し，また，ある薬剤の結果のみが一貫して問題であると指摘された場合は，その薬剤のすべてのデータを最終解析に含まなかった． 最終的な解析には、8カ国24名の参加者の感受性試験データを使用しました。
感受性試験方法。 すべての参加者は、非固定性グラム陽性病原体の標準ディスク拡散法、または連鎖球菌の種をテストする際にEtest（MIC）方法（AB BIODISK、スウェーデン、ソルナ）を使用しました。 連鎖球菌以外の菌種に対しては，Mueller-Hinton寒天培地を用いたディスク拡散法により13種類の抗菌薬を評価し，グラム陽性スペクトル化合物および広域スペクトル化合物を含む抗菌薬の評価を行った。 検討した薬剤は，linezolid，MLSB，b-lactam，glycopeptides，trovafloxacin，chloramphenicol，doxycyclineおよびgentamicin（高濃度，Enterococcus spp.のみ）であり，linezolid，MLSB，doxycyclineおよびgentamicinは，Mueller-hinton寒天培地を用いたディスク拡散法で評価した。 合計6種類の化合物（linezolid、quinupristin/dalfopristin、penicillin、erythromycin、ceftriaxone、trovafloxacin）について、5％羊血を添加したミューラーヒントン寒天培地で連鎖球菌の分離株に対する試験が行われた。 すべての方法と解釈基準は，NCCLSおよび/または製造業者の推奨に準拠した． Linezolidのディスク拡散解釈基準は，ブドウ球菌，肺炎球菌，肺炎球菌以外のレンサ球菌では感受性が21 mm，腸球菌では感受性が23 mm，耐性が20 mmであった。 MIC法（Etest）を用いた場合のlinezolidの感受性は、連鎖球菌で£2 mg/mlと定義された。
結果
ブドウ球菌に対するlinezolidの活性。 表1にブドウ球菌1,582株に対するlinezolidの標準ディスク拡散法による活性およびスペクトラムを示した。 linezolid，キヌプリスチン／ダルホプリスチン，バンコマイシンは，試験したすべてのブドウ球菌に対して完全な活性（100％感受性）を示した。 Teicoplaninはin vitroでほぼ同等の効果を示したが，まれに（0.7～6.7％）非感受性域のゾーンを示した株があった。 最も有効な4薬剤のゾーン径の中央値は，わずかな差であったが，キヌプリスチン/ダルフォプリシンのS. aureus株に対する効力（25 mmまたは26 mm）は，CoNS分離株（29～30 mm）に対して減少していることが最も明らかであった。
他の7つの比較薬剤の活性は、oxacillin耐性株で低かった。 例えば、oxacillin耐性S. aureus（ORSA）の感受性率は、cefazolinで99.5%、ceftriaxoneで94.2%、clindamycinで78.6%、erythromycinで69.1%、クロラムフェニックで43.2%、doxycyclineで19.5%、トロバフロキサシンで10.4%低減していたのです。 新しいフルオロキノロンであるトロバフロキサシンは，ORSAの89.1％，OR-CoNSの87.7％に対して活性を維持した．
バンコマイシン感受性腸球菌に対するリネゾリド活性。 表2にvancomycin感受性E. faecalis，E. faeciumおよびその他の腸球菌27種の計599株に対するlinezolidのディスク拡散試験による活性の推移をまとめた。 linezolid，vancomycinおよびteicoplaninは，これらの菌株に対して高いin vitroスペクトルを示した（93.1～100.0％の感受性，耐性株はゼロ）。 キヌプリスチン／ダルフォプリスチンは，バンコマイシン感性E. faeciumの92.8％に有効であったが，E. faecalisの13.4％とその他の腸球菌の57.1％にのみ有効であった。 アンピシリンは，E. faecalis（96.5％感受性）と他のEnterococcus属（92.9％）に対して引き続き治療選択肢となったが，E. faecium（42.2％）に対しては無効であった。 セファロスポリン、マクロライド、クリンダマイシンは一般にin vitroでは効果がなかった。 他の試験薬で最も広いスペクトルを示したのは，E. faecalisに対するクロラムフェニコール（感受性64.0%）とトロバフロキサシン（73.4%），E. faeciumに対する同2剤とドキシサイクリン（59.0～78.3%）だった。
バンコマイシン耐性腸球菌に対するリネソリド活性について検討した。 今回の多施設共同調査で分離された腸球菌（VRE）のうち，バンコマイシン耐性は比較的珍しく，22株（3.5％）のみ検出された。 これらの菌株の菌種別分布は以下の通りであった（表3）。 E. faecalis（7株），E. faecium（14株），Enterococcus spp.（NOS）（1株）であった。 VREは2カ国（アルゼンチン，ブラジル）のみから検出された． アルゼンチンでは14株のVREが確認され，そのうち1株はvan C表現型を，13株はvan A表現型を有していた． 一方、ブラジルではVREのE. faeciumは1株（van A）のみで、残りの7株はE. faecalisに見られるvan A表現型だった。
表3に、中南米のVRE 22株を試験した際の、5種類の抗菌ディスク（linezolid、キヌプリスチン/ダルフォプリスチン、アンピシリン、クロラムフェニコル、ドキシサイクリン）でのゾーン径分布が報告されている。 linezolidのゾーン径はすべて感受性範囲（24 mm）であり，表3に示した他の薬剤とは対照的であった． また，他の薬剤の感性率は40.9％（アンピシリン）～63.6％（クロラムフェニコール，ドキシサイクリン）であった。 アルゼンチン産VRE E. faeciumの84.6％にキヌプリスチン／ダルフォプリシンが有効であった。ブラジル産は中間の感受性パターンであった。 ブラジル産のVRE（E. faecalis）はいずれも新規のストレプトグラミン併用薬に感受性を示さなかった。
リネゾリドのS. pneumoniaeに対する活性。 このin vitro試験の肺炎球菌株はEtest（AB BIODISK）で試験され，15 log2希釈スケールで正確なMIC結果が作成された（表4）。 リネゾリド、キヌプリスチン／ダルフォプリスチン、トロバフロキサシンは、試験した339の肺炎球菌すべてに対して、NCCLSブレイクポイント以下のMIC値で活性を示した。 これらの強力な薬剤はいずれも、ペニシリン（表4）やマクロライドに対する耐性によって活性に悪影響を及ぼすことはなかった（データは示していない）。 LinezolidのMIC50（0.5 mg/ml）およびMIC90（0.75 mg/ml）は，ペニシリンに対して感受性，中間耐性，または耐性であるS. pneumoniae株で変化しなかった（表4）． 一方，erythromycinおよびceftriaxoneの効力および／またはスペクトラムは，penicillinに対する耐性が強くなるにつれて減少した。 ceftriaxoneはpenicillin耐性S. pneumoniaeに対して60倍以上低い活性を示したが，第3世代セファロスポリンとして90.0％の株（MIC：1 mg/mlポンド）に有効であると判定された。
他の連鎖球菌に対するリネゾリドの活性について。 残りのb型溶血性レンサ球菌およびviridans groupレンサ球菌（98株）のMIC結果を統合し，累積阻害率表として示した（表5）。 linezolidのMIC値はすべて2 mg/mlポンドであり，MIC50およびMIC90の結果はそれぞれ0.5 mg/mlと1 mg/mlであった。 また，Trovafloxacinはブレイクポイント以下の濃度で全株を阻害し，quinupristin/dalfopristinは1株のみ耐性を示した。 試験管内で最も効果が低かったのはerythromycinで72.5％の感受性であり，penicillinの感受性は86.7％にすぎなかった。 ペニシリン耐性株はすべてviridans group streptococcal分離株の中に含まれていた。
考察
オキサゾリジノン系の開発は，問題となる耐性グラム陽性球菌に有効なクラスの抗菌薬へのニーズに応えることに成功した。 本研究では、中南米の患者から分離されたこれらのグラム陽性菌に対するlinezolidの普遍的な活性を確立した。 これまで，linezolidは腸球菌，ブドウ球菌，連鎖球菌に対して，狭い範囲のMIC値（0.5～4 mg/ml）で有効であると報告されてきた。 これらの結果は、リネゾリドのスペクトルに関する様々な国家レベルおよび地域レベルのサーベイランス研究によって立証されています。
オキサゾリジノンが50Sリボソームサブユニットに結合して開始複合体を阻害するという、タンパク質合成に対する独自の作用機序により、事前に選択された変異の可能性を最小限に抑え、他の薬剤との交差耐性は観察されていない。 しかし，臨床試験中の延長化学療法により，特に感染性留置器具を装着した患者においてlinezolid耐性株が出現している。 また，linezolidの臨床導入後，linezolid不応性のEnterococcus spp.が2例，linezolid MIC 32 mg/mlのS. aureusが1例報告されており，linezolidの臨床導入が期待されている。 これらの菌は，実験室由来の変異体ではG2447UとG2528Uに，臨床例ではG2576Uに23S rRNA遺伝子変異を有しており，耐性機構が検討されてきた． このような変異はまれであり，linezolidの長期投与を受ける患者は，耐性株の出現に注意する必要がある。実際，変異株のlinezolid MICは8 mg/ml（感受性ブレイクポイントの1 log2希釈）までしか上昇しないため，高品質の感受性試験法と試薬が必要である。 このような耐性変異は、グリコペプチド、ストレプトグラミン、リファンピン、マクロライドなどの投与を受けている患者のグラム陽性菌で早くから確認されている。 さらに、リネゾリドまたはキヌプリスチン／ダルフォプリスチン耐性腸球菌による環境汚染が、オキサゾリジノン投与歴のない患者の院内感染を引き起こし、患者を危険にさらすという証拠が現れています。
現在、ラテンアメリカでは、リネゾリドの活性とスペクトルは、モニターされた薬剤の中で最も完全であり、オキサゾリジノンは、多剤耐性グラム陽性球菌の幅広い感染治療に適用できると思われます。 この基本的な評価は，腸球菌，ブドウ球菌，連鎖球菌に対する新しい薬剤（ストレプトグラミン，オキサゾリジノン，後発フルオロキノロン，新規グリコペプチド）のその後のすべての調査の参考となるべきものである。 Linezolidの好ましいスペクトルにかかわらず，治療指針として感受性試験を実施し，非感受性範囲試験の結果を基準検査機関に転送して確認と遺伝子解析を行う必要がある。
謝辞
原稿の作成および本研究の実施にご協力いただいた以下の方々に感謝いたします。 K. Meyer, M. Adelman, G. Wilton, and J. Schentag. 本研究は、ファルマシア& アップジョン社からの教育・研究助成金によって実施されたものである。
1. この研究は、ファルマシア
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