ミオスタチン阻害剤の単一遺伝子投与による骨格筋量と筋力の長期増強

結果と考察

AAVによる筋肉への遺伝子導入は、標的組織内または循環を通じて遠隔地に運ばれる分泌物によって高レベルのタンパク質を生成するシステムを提供する(19)。 我々は、成長分化因子関連血清タンパク質-1（GASP-1）（18）、フォリスタチン関連遺伝子（FLRG）（17）、フォリスタチン-344（FS）（13）などの既知の分泌型ミオスタチン抑制遺伝子をAAV血清型1にクローニングし、高い筋肉導入能を実証している。 フォリスタチンには、オルタナティブスプライシングによって生成される2つのアイソフォームが存在する。 FS-344 変異体はペプチド切断を受け FS-315 アイソフォームを生成し、もう一方の FS-317 変異体はペプチド切断後 FS-288 アイソフォームを生成する。 我々は、血清中に存在するFS-315アイソフォームのみを生成し、C末端に酸性領域を含むヒトFS-344バリアントを使用した(20)。 FS-344（FS）を選んだのは、C末端を欠くもう一つのFS-317アイソフォームが卵巣卵胞液に優先的に局在し、ヘパリン硫酸プロテオグリカンを介して高い組織結合親和性を示し、生殖能力に影響を与えたり、他の標的外部位に結合する可能性があるからである(21)。 FS-288はフォリスタチンの膜結合型であり（22）、下垂体卵胞刺激ホルモンの強力な抑制因子であり（23）、卵巣の卵胞液と精巣に存在し、卵巣の顆粒膜細胞に高い親和性を示す。

正常マウスとジストロフィーマウスの筋肉量を増やすためのこれらの蛋白質の有効性について検討した。 FS、FLRG、GASP-1、GFPをコードするAAV1ウイルス粒子を4週齢の野生型C57BL/6マウスの大腿四頭筋と前脛骨筋に1匹あたり両側から投与した。 ミオスタチン阻害剤を投与したすべての動物は、725日齢でGFPを投与した対照群と比較して、筋肉の観察可能な総量増加を伴う体格増加を示した（図1 aおよびb）。 個々の筋肉重量を評価したところ、すべてのミオスタチン阻害剤処理動物で筋肉量の増加が見られ、FS処理動物で最も大きな増加が見られた。 筋量の増加は、注射した後肢の筋肉と、上腕三頭筋のような注射部位から離れた筋肉に見られた。 このように、これらの阻害剤は筋肉注射をした部位から循環中に分泌され、離れた部位の骨格筋量を増加させた（Fig.1 c）。 筋量の増大は、後肢の握力の増加によって示される機能的改善を伴っていた（Fig.1 d）。 心筋量や心筋細胞の組織学的外観には影響がなかったことから、ミオスタチン阻害は骨格筋組織に選択的に作用することが示された（データは示さず）。 FS は生殖腺機能に悪影響を及ぼすことが懸念されている。 さらに、FSを投与したマウスの生殖器組織には、コントロールと比較して組織学的・病理学的な変化は認められなかった（データは示さず）。

ミオスタチン抑制タンパク質は、野生型C57BL/6マウスの筋肉量と筋力を増加させる。 (a）後肢の総筋肉量は、AAV1-GFPを注入した対照と比較して、725日齢のすべてのミオスタチン阻害剤タンパク質処理マウスで増加する。 (b）総体重は、725日齢のAAV1-GFP対照と比較して、AAV1-FS注入（＊＊、P≦0.01）及びAAV1-GASP-1注入（＊、P≦0.05）マウスで有意に増加している（n = 10）。 (c）ミオスタチン阻害タンパク質を発現するAAVを注射したマウスでは、個々の後肢および前肢の筋肉の質量が増加している（n = 10）。 *, P ≤ 0.05. (d）後肢の握力は、AAV1-GFP対照と比較してAAV1-FS処理動物において最大の差異を有するすべての処理マウスにおいて>2年改善する（n＝10）。 エラーバーは標準誤差を表す。

FS送達の強力な効果を考慮して、次に、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）のmdxマウスモデルで筋肉量および強度を増加させ、筋肉の劣化を遅らせるために、臨床的に意味のあるパラダイムで生後投与したAAV1-FSの潜在能力をテストしました。 DMDはX連鎖性劣性疾患で、骨格筋と心機能が衰え、最終的には死に至ります。 最近、フォリスタチン遺伝子の重複ドメインを過剰発現させたmdx動物でFSが研究された。 その結果、筋肉量の増加と病態の抑制が確認されたが、その結果は15週齢までしか記録されていない(24)。 我々の研究では、mdx動物に低用量（1×1010ウイルス粒子）または高用量（1×1011ウイルス粒子）のAAV1-FSを3週齢で大腿四頭筋と前脛骨筋の両側に注射し、剖検前に5カ月間追跡調査した。 低用量および高用量処理動物の血清中に循環FSの増加レベルが検出され、高用量は血清検出FSの最大レベルを発現した（高用量, 15.3 ± 2.1 ng/ml; 低用量, 6.8 ± 0.4 ng/ml; GFP対照, 0 ± 0.1 ng/ml; n = 8 per group; P < 0.01). AAV1-FSがGFP処理対照と比較して体格を増加させ、高用量FS群で最も増加することを実証した（データ示さず）。 AAV1-FS処理マウスの肉眼観察は、AAV1-GFP処理動物と比較して筋肉サイズの有意な増加を示し（図2 a）、高用量FS処理動物における個々の筋肉重量増加が最大であった（図2 b）。 効果は注射した筋肉に限られたものではなく、直接標的とした筋肉から離れた部位でも見られた（Fig.2 b）。 筋量の増加は、後肢および前肢の筋力において、GFP投与対照と比較して用量依存的に改善した（図2c）。 AAV1-FSを注入した筋肉と遠隔部位の組織学的および形態学的解析により、筋繊維の肥大が確認され、剖検時の肉眼観察を裏付けた（図3 a-c）。 さらに、AAV-FS処理動物では筋線維のタイプに変化はなかったが、高用量のAAV-FSで処理した動物では、前脛骨筋の面積1平方ミリメートルあたりの総繊維が少なかった（図3 dおよびe）。 驚くべきことに、FSを投与したマウスは、GFPを投与した対照群と比較して、血清クレアチンキナーゼの有意な減少を示した（図4 a）。 これは興味深いことで、ジストロフィンの欠損を補正しないにもかかわらず、FSが保護的であったからである。 正確なメカニズムは不明であるが、個々の線維の強度を高めることで、通常の活動時のストレスによる損傷を受けにくくなるのではないかと推測される。 出生後のミオスタチン抑制における衛星細胞の関与は、まだ完全に解明されていない。しかしながら、FS処置した動物について、筋衛星細胞マーカーにおける統計的変化は見られなかった（データは示されていない）。

我々はまた、AAV1-FSが高齢で処理された場合にmdx動物の筋力を増加させる可能性を評価した。 我々は、210日齢でのAAV1-FS注射が、投与後≒60日目に筋力を増加させ、筋力の増加が、本研究で評価した560日を通して長期的に持続することを見出した（図4 b）。 AAV1-FS投与前の180日齢の時点で、未投与のmdx動物の筋肉には、内膜結合組織の増殖と炎症が顕著な病理が見られた（図4 c、d）。 560日齢の腓腹筋と横隔膜の病理学的評価では、AAV1-FS処理動物では壊死した筋線維の焦点群や単核細胞浸潤が大幅に減少していることが確認された。 重要なことは、AAV1-FS処理動物では、GFP処理動物で顕著であった内膜結合組織増殖の局所領域が著しく減少しており、筋ジストロフィーの特徴である線維化がFS処理動物で減少していることが示された（図4c）。 横隔膜の病理学的検査でも、FS処理によりGFP処理動物に比べ、炎症と脂肪の置換が減少していることが示された（Fig. 4 d）。 さらに、AAV1-FS処理は、対照のGFP処理動物と比較して、この年齢で筋繊維径の有意な増加を示した（図4のcとd）。 これらの結果から、FS処理によるミオスタチン阻害は、筋変性と再生を何度も繰り返した高齢のmdx動物に有効であることが示された。

これらの結果は、AAV1注射によって送達されるFS-344によるミオスタチン阻害が、筋肉のサイズおよび強度を増強し、>2 年間の忍容性があることを示唆した。 FS344の結果は、フォリスタチンが複数のシグナル伝達経路に関与するなどの相加効果や、エンドトキシン血症モデルにおける炎症の軽減を実証する最近の知見（15、26）により、ミオスタチンだけを標的とする他の戦略よりも強力な戦略を提供することができるかもしれない。 高齢のDMD患者を含む筋骨格系疾患を治療するための臨床開発において、高齢動物のジストロフィー筋に肉眼的および機能的な長期的改善をもたらすフォリスタチンの驚くべき能力は、その検討を保証するものである。