我が国の慢性骨髄増殖性症候群におけるJAK2遺伝子V617F変異の判定：症例報告
我が国の慢性骨髄増殖性症候群におけるJAK2遺伝子V617F変異の判定：症例報告
Dr. Daniela Lens*, Pablo Muxi†, Lics. Andreína Brugnini‡,
Natalia Trías‡, Dra. Silvia Pierri§
臨床病院です。 医学部。
共和国の大学。 Montevideo, Uruguay
要旨
真性多血症（PV）、本態性血小板血症（ET）、特発性骨髄線維症（IM）は、骨髄における赤血球、血小板、線維芽細胞などの一つ以上の髄細胞系の過剰増殖によって特徴づけられる密接な関連のあるクローン性の骨髄増殖性疾患である。
これらの骨髄増殖性症候群の診断には厳密な基準が存在しますが、正確な分類は依然として議論の余地があり、さらにこれらの疾患は多くの場合、反応過程との区別が困難です。
最近では2005年に、これらの疾患のいくつかでヤヌスキナーゼ2（JAK2）チロシンキナーゼ遺伝子に変異が確認されています。
この変異は、1849位のGがTに置換され、タンパク質中のフェニルアラニンがバリンに置換されています（JAK2 V617F）。この変異の発生率は、PV症例の約90％、IMおよびET症例の約50％に認められました。
本論文では、Probable PVと診断された患者において、この変異を検出するための高感度アレル特異的ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）アッセイを用いて検出したことについて述べ、BCR-ABL陰性骨髄増殖症候群の診断と治療において最近見つかったこの変異の重要性について考察します。
キーワード：MYELOPROLIFERATIVE DISORDERS – diagnosis.
突然変異 – genetics.
PROTEIN-TYROSINE KINASE.
*助教授。 医学部基礎学科。
† 准教授。 血液内科クリニック
生化学教室
筑波大学大学院医学系研究科博士課程修了。 アシスタント 基礎医学部。
§准教授。 血液内科クリニック 臨床医学部門
通信員：ダニエラ・レンズ博士。
部門です。 基礎医学。 ホスピタル・デ・クリニカス Piso 15. Avda Italia s/n. Montevideo CP 11600。 ウルグアイのモンテビデオ。
Email: [email protected]
受付：2006年7月31日。
受理：2007年2月26日。
はじめに
慢性骨髄性白血病では、特定のBCR-ABL再配列の同定により、この疾患の診断、モニタリング、治療において飛躍的な進歩がもたらされたのとは対照的です。 BCR-ABL陰性慢性骨髄増殖性症候群（PMS）である真性多血症（PV）、本態性血小板血症（ET）、特発性骨髄線維症（IM）では、ごく最近まで特定の遺伝子変異は知られていませんでした。
2005年5月から6月にかけて、5つの研究グループがJAK2チロシンキナーゼ遺伝子における新しい点変異を報告しました。これは、エキソン14のヌクレオチド1849においてグアニンがチミンに置換され、タンパク質の617位がバリンからフェニルアラニンに置換されているもので、JAK2変異はV617F（1-5）と名付けられました。
この変異は、高感度アッセイで検出した場合、PVの約90％の症例で観察された(6)。 また、健常者や二次性赤血球増加症の患者では見つかっていない一方で、IMやETの症例の約50％に見つかっており、この変異はSMPCと二次性多血症などの非クローン性疾患を区別する上で非常に高い予測性を持っているといえます。
この変異は、JAK2シグナルを負に制御する自己抑制ドメインの高度に保存された領域で起こっています。 いくつかの研究により、この変異がこれらの疾患の病因に関与していることが示されており、特に、これらの疾患の過剰な骨髄増殖に関連するJAK2遺伝子の機能獲得と制御不能によるものであることが判明しています。
本論文では、probable PVと診断された患者におけるこの変異の検出について述べ、BCR-ABL陰性SMPの診断と治療におけるこの新しい変異の重要性について議論します。
材料と方法
デオキシリボ核酸抽出
市販試薬dnazol（Life Techno-logies）を用い、メーカーが示すプロトコルに従って、1mlのクエン化末梢血からゲノムデオキシリボ核酸（DNA）抽出を行った。 DNAサンプルは4℃で保存した。
Vl617F変異の検出
V617F変異は、Baxterら（1）が発表した方法に従って、事前に入手したゲノムDNAから対立遺伝子特異的ポリメラーゼ鎖反応（PCR）で検出された。 このPCRでは、JAK2R、JAK2F/IC、JAK2Fと呼ばれる3種類のプライマーを使用するよう設計されている（表1）。 JAK2Fプライマーは変異アレルに特異的であり、JAK2F/ICプライマーは変異の有無にかかわらず全ての個体に存在するため、反応の内部コントロールとなる。 このように、すべての個体でJAK2F/ICとJAK2Rのプライマーで364塩基対（bp）の産物が増幅され、研究対象の変異を持つ個体でのみ、JAK2FとJAK2Rのプライマーを用いて203bpの産物が得られる（図1）。
PCR増幅は、500 ngのDNA、200 mM/Lの各dNTP、0.5 UのTaq polymerase（New England Biolabs）、2 mM MgCl（New England Biolabs）を含む10x Taq buffer 2 uL、JAK2 FとJAK2 F/ICプライマー0.5 mM、JAK2 R プライマー1 mMを用いて最終容量20 uLで実施された。
使用したPCRプログラムは、5分間の変性から始まり、94℃で30秒、58℃で30秒、72℃で30秒のサイクルを36サイクル行い、最後に5分間の伸長で終了します。 増幅に必要なすべての試薬を含み、DNA鋳型を水に置き換えたネガティブコントロールは、すべての反応に常に含まれていた。 期待されるPCR産物の検証は、エチジウムブロマイドで染色した2%アガロースゲルで行った(7)。
事例分析
男性患者、72歳、ヘビースモーカー、治療中の慢性動脈硬化症、2002年に左足第5指の切断を決定した慢性閉塞性動脈硬化症のキャリアである。 2004年12月、左下肢に新たな閉塞症状を呈し、血液検査では赤血球数の増加、ヘマトクリット66％、顆粒球増加24,000、血小板245,000が認められた。 ヘマトクリットは変わらず、血小板数は71万まで漸増した。 骨髄生検では、赤血球系列の過形成を伴う過細胞骨髄が観察され、PV型の慢性骨髄増殖性症候群と判断された。
瀉血を行い、2005年5月からヒドロキシウレアによる治療を開始したが、2006年2月に出血性合併症により中止した。
図2に示すように、JAK2遺伝子のV617F変異に対する対立遺伝子特異的PCR検査では2つのバンドを有するパターンを示した。 一方、364bpのコントロールバンドは、調査した2人の健常対照者にも存在するものである。 一方、この患者さんでは203bpの産物も増幅され、変異の存在を示しました。
考察と結論
今回の研究では、我が国で初めてJAK2遺伝子のV617変異が同定された症例について述べた。
最近、JAK2遺伝子の活性化V617F変異が明らかになったことは、BCR-ABL陰性の骨髄増殖性症候群の病態に関する知識の重要な進展と言えます。 この変異はPVで高い頻度で認められ、ETやIMではそれほどでもないことから、この変異の検出はこれらの疾患の診断、分類、治療に強い影響を与えると推測されています。 JAK2 V617Fの検出はPVの診断に対して100％の陽性適中率を有することから、ヘマトクリット値が51％以上の場合、あるいはPVが疑われる場合にこの変異の検出を第一選択診断検査として取り入れることが様々なグループから提案されている（8,9）。 一方、JAK2遺伝子変異を有するET、PV、MIは、異なる進化段階にある同一疾患である可能性があるため、この変異の存在はPMSの新しい分類を可能にすると複数の著者は主張している(10-12)。
さらに、この変異の発見は、慢性骨髄性白血病におけるBCR-ABL阻害剤と同様に、変異したプロテインキナーゼを特異的に標的とする治療法の新しい可能性を開くものです。
概要
真性多血症（PV）、本態性血小板血症（ET-TE）、特発性骨髄線維症（IM-MI）は、骨髄の赤血球、血小板、線維芽細胞などの骨髄系細胞の過剰増殖が特徴のクローン性骨髄増殖性疾患であります。
骨髄増殖性症候群の正確な分類は、診断基準が厳密であってもまだ議論される必要があり、さらにこれらの疾患は反応性プロセスとの区別が困難である。 JAK2のコーディング領域の塩基配列を解析したところ、1849位でGからTへの変換が起こり、バリンからフェニルアラニンに変化していました（JAK2 V617F）。
V617F-JAK2変異はPV患者でほぼ90％、IMおよびET患者で50％の確率で認められました。
本研究では、PVが疑われる患者において、対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応分析（PCR）を用いてV617F-JAK2-変異を検出したことについて述べ、陰性BCR-ABL骨髄増殖症候群の診断および治療におけるこの変異の重要性について考察する。
レジュメ
ベラ型多血症（PV）。 本態性血小板血症（ET）と特発性骨髄線維症（IM）は、赤血球、血小板、骨髄線維芽細胞などの1つ以上の骨髄系細胞の過剰な増殖を特徴とする、密接に関連したクローン性骨髄増殖性疾患である。
これらの骨髄増殖症候群の診断には厳密な基準がありますが、正確な分類についてはまだ議論の余地があり、さらに、これらの疾患はいくつかの場面で反応性のプロセスと区別することが困難です。
最近では、2005年にチロシンキナーゼ遺伝子であるヤヌスキナーゼ2（JAK2）の変異が、これらの疾患のいくつかで確認されています。
この変異は、PVの約90％、MIおよびTEの約50％に認められます。
本研究では、Probable PVと診断された患者において、この変異を高感度で検出できる対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）アッセイにより検出したことを述べ、BCR-の診断および治療におけるこの新しく発見された変異の重要性について議論します。ABL陰性骨髄増殖性症候群。
概要
ベラ陽性血腫（PV）、血栓性血腫（TE）、特発性軟骨線維症（MI）は、強い関連性を持つ一群の軟骨増殖性疾患で、海中の篩骨、板骨、線維芽細胞などの複数の軟骨の過剰増殖によって特徴付けられます。
軟骨増殖性症候群の診断には厳密な基準が存在しますが、その分類については議論が続いており、多くの場合、これらの異質な疾患を再臨界のプロセスで区別するのは非常に困難です。
2005年、これらの疾患のいくつかで、チロシンキナーゼであるヤヌスキナーゼ2（JAK2）の遺伝子に変異があることが判明しました。
この変異はPVの約90％、MIおよびTEの約50％に認められました。
本論文では、PVと診断された患者において、この変異を検出するための高感度な対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）アッセイを用いて検出したことについて述べ、BCR-ABL陰性骨髄増殖症候群の診断および治療におけるこの新しく発見された変異の重要性について考察します。
参考文献
1.バクスターEJ、スコットLM、キャンベルPJ、イーストC、フロウクラスN、スワントンS、他、ヒト骨髄増殖性疾患におけるチロシンキナーゼJAK2の後天的変異について。 Lancet 2005; 365: 1054-61.
2. James C, Ugo V, Le Couedic JP, Staerk J, Delhommeau F, Layout C, et al. 構成的シグナル伝達を引き起こすユニークなクローン性JAK2変異は、真性多血症を引き起こします。 Nature 2005; 434: 1144-8.
3. Kralovics R, Passamonti F, Buser AS, Teo SS, Tiedt R, Passweg JR, et al. JAK2 の機能獲得変異は骨髄増殖性疾患患者に頻繁に見られる。 N Engl J Med 2005; 352: 1779-90.
4. レビンRL、ワルドレーM、クールスJ、エバートBL、ワーニングG、ハントリーBJ、他。 真性多血症、本態性血小板血症、骨髄線維症を伴う骨髄異形成におけるチロシンキナーゼJAK2における活性化変異。 Cancer Cell 2005; 7: 387-97.
6. Vainshenker W, Constantinescu SN. JAK2 のユニークな活性化変異（V617F）は、ベラ多血症の起源であり、骨髄増殖性疾患の新たな分類を可能にする。 Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2005; 195-200.
7. Sambrook J, Russell DW. 分子クローニング：実験室マニュアル。 3版。 New York: コールドスプリングハーバーラボラトリー、2001年。
8. Tefferi A, Pardanani A. JAK2V617Fの変異スクリーニング：いつ検査を依頼し、結果をどう解釈するか。 Leuk Res 2006; 30(6): 739-44.
9. James C, Delhommeau F, Marzac C, Teyssandier I, Couedic JP, Giraudier S, et al. 赤血球増加症の第一選択診断検査としてJAK2 V617Fの検出を行った。 Leukemia 2006; 20: 350-3.
10. Campbell PJ, Scott LM, Buck G, Wheatley K, East CL, Marsden JT, et al. JAK2 V617F変異の状態に基づく本態性血小板血症のサブタイプの定義と真性多血症との関連：プロスペクティブスタディ。 Lancet 2005; 366: 1945-53.
11. Antonioli E, Guglielmelli P, Pancrazzi A, Bogani C, Verrucci M, Ponziani V, et al. Clinical implications of the JAK2 V617F mutation in essential thrombocythemia.本態性血小板血症におけるJAK2 V617F変異の臨床的意義。 白血病 2005; 19: 1847-9.