Role of Candida in Antibiotic-Associated Diarrhea

要旨

抗生物質関連下痢症（AAD）におけるカンジダ種の役割を定量的に評価するために、患者および対照者合計395人の便サンプルを分離培地を用いて培養を行った。 AAD患者98名、抗生物質を服用しているが下痢をしていない患者93名（A+D-）、抗生物質を服用していないが下痢をしている患者97名（A-D+）、対照者107名（A-D-）であった。 また、分泌型アスパルチルプロテアーゼ（Sap）産生量も検査した。 AAD患者におけるCandida陽性率（77/98）およびCandida過剰増殖率（62/98）は，A+D-患者（それぞれ75/93，52/93）と変わらなかった． A-D+患者のCandida過剰増殖（40/97，P=.003）はAAD患者より少なかったが，Candida陽性率（80/97，P=.612）は変わらなかった． 対照群では，Candida陽性および過剰増殖は，他のすべての群に比べ少なかった． Sapの産生量は、AAD患者と対照被験者で差がなかった（それぞれP=.568とP=.590）。 データは、カンジダ数の上昇は、AADの原因ではなく、抗生物質治療や下痢の結果であることを示している

口腔内の鵞口瘡と食道炎は、カンジダ感染症の最も一般的な病理症状である 。 抗生物質関連下痢症（AAD）におけるカンジダの役割については議論がなされてきた。 抗生物質投与後の下痢は、糞便中のカンジダ菌濃度が105cfu/mLに達することで発症すると考えられている。 下痢を起こさず抗生物質を投与された患者には、<105 cfu Candida fungi/mL stool

分泌型アスパルチルプロテイナーゼ（Saps）はカンジダ菌が作り出す重要な病原性因子であり、その分泌型Sapsはカンジダ菌に感染した場合、下痢を起こす可能性があると言われています。 SapsはCandida albicansのヒト粘膜への付着やヒト組織への浸潤に関与している。 ヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染者の口腔カンジダ症やカンジダ膣炎では、Sapsの発現とカンジダの病原性の相関が証明されている。 カンジダ関連AADでは、真菌の毒素あるいは毒素様物質を介した活性分泌が下痢の発症機序として議論されている。 C. albicansでは、10種類のSAP遺伝子が同定されている。 Candida tropicalisでは弱い細胞外タンパク質分解活性が認められるが、Candida glabrataではタンパク質寒天培地上でタンパク質分解活性は認められない

C. albicansは、タンパク質を唯一の窒素源とする培地で培養するとアスパルチルプロテアーゼを生成し、SAP2遺伝子の発現によって、試験管内の酵母形態で増殖するほとんどの菌株で見られるタンパク質分解活性が主に担っていると知られている。 SAPは消化管においてもタンパク質分解活性を示す。口腔カンジダ症におけるSAPの発現と、SAPによる消化管ムチンの分解が証明されている。 酵素による消化管ムチンの分解は、多くの腸内病原体（例えば、Vibrio cholerae、Shigella種、Helicobacter pylori、Yersinia Enterocolitica）の病原性の決定因子として関与している。 粘膜表面に定着するC. albicansは、SAP2によるムチンの分解によって、上皮細胞への接近や細胞表面の改質が可能になると考えられている。 小児急性・慢性下痢症患者の分泌型Candida acid proteinaseは健常対照群より高値であった

成人AAD患者におけるCandida属の病原性との関連性を明らかにするため、免疫力のない成人395名を対象にCandida属の定量便培養を実施した。 また、Sapsの産生についても検討した

方法

患者の選択と便サンプルの収集250床の内科の全患者を対象に、11ヶ月間毎日下痢の有無、下痢がない場合の抗生物質投与について調査した。 下痢の定義は、>1 日あたり 3 回の泥状または水様便とした。 抗生物質の投与は，治療量の抗生物質を1日経口または静脈内投与したものと定義した。 AADの定義は、>3 mushy or watery stools per day during or up to 2 months after antibiotic treatment …とした。 統計学的比較に必要な所定の人数に達するまで、患者を4つの試験群に連続的に募集した（下記の統計学的解析を参照）。 患者は入院中に一度だけ組み入れられた

下痢をしたすべての患者の便サンプルを、選択寒天で細菌病原体（サルモネラ、赤痢菌、エルシニア、カンピロバクター）の培養、卵と寄生虫の検査、選択寒天での培養と迅速C. difficileテスト（BD）を使用したClostridium difficile検査で検査した。 これらの病原体のいずれかが検出された患者は、研究から除外された。 こうして、395人の患者（下痢のある患者195人、ない患者200人）が研究に組み込まれ、4群に割り当てられた。 (1）A+D+群：抗生物質を投与され下痢を経験しているAAD患者98名、（2）A+D-群：抗生物質を投与されているが下痢を経験していない患者93名、（3）A-D+群：抗生物質を投与されていないが下痢を経験している患者97名、（4）A-D-群：抗生物質を投与されておらず下痢を経験しない対照被験者107名

4群は性・年齢分布に差がなかった。 すべての被験者の便は排便直後に採取され、15分以内に同じ建物の実験室に持ち込まれた。 夜間に通過した便のサンプルは4℃で保存し、翌朝に処理した

カンジダ培養とスライドスミア便サンプルは生理食塩水で1:10に希釈し、便ホモジナイザーで撹拌し、再び生理食塩水で1:1000と1:10000に希釈された。 各希釈液100マイクロリットルをCandida CHROMagar（BBL）に移し、滅菌綿棒を用いて均一にプレーティングした。 37℃、48時間大気中で培養後、Candidaコロニーを数え、コロニーの色によりC. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalisまたはその他のCandida種に分類した。 コロニー数が105cfu/mLの便をDannaらによる「Candida overgrowth」に分類した． 連続した最初の100便の希釈ごとのスライドスミアはグラム染色し、酵母と白血球の存在を光学顕微鏡で観察した

サップの検出患者グループA-D-とA+D+から連続分離したカンジダは、他の記述に従って、ウシ血清アルブミン（BSA）寒天（酵母炭素塩基 1.17% 、酵母エキス 0.01% 、BSA 0.2% ）でアスパルチルプランテアーゼ分泌量を検査した。 培地は pH 5.0 に調整し、ろ過（孔径 0.2 μm）により滅菌し、オートクレーブ（2%）寒天のストック溶液に添加した。 酵素活性を示すタンパク質分解をミリメートル単位で測定し、他で提案されているようにスコア化した: – または±（コロニー周辺の寒天の透明化が見られないか、ごくわずかであった）、1+（顕著なタンパク質分解が観察された）、2+（寒天の透明化がコロニーの縁を大きく超えていた）であった。 C. albicans SC5314株とSAP2欠損変異体（B. Hube, University of Hamburg, Germany提供）を対照として調べた

統計解析カンジダ数の異なる患者数をχ2検定で比較し、スライドスミア上の酵母数と培養によるカンジダ数をピアソンの相関を用いて相関させた。 Sap産生量の差はStudentのt検定およびFisherの正確検定により算出した． 培養試験のサンプルサイズは91人、樹液試験のサンプルサイズは各群20人とし、αは0.05、検出力は0.8とした（SigmaStat, version 2.0; Jandel Scientific）。 P<.05 の差を有意とした

結果

カンジダ培養とスライドスミアカンジダ培養の結果を図1に示す。 A+D+群では、カンジダ陽性（77/98人）、カンジダ過剰増殖（62/98人）は、A+D-群（75/93人、52/93人）と有意差はなかった。 A-D+群では，A+D+群に比べCandida過剰増殖が有意に少なかったが（P=.003），Candida陽性率は有意差を認めなかった（P=.612）． また、A-D-群では、Candida陽性および過剰増殖が他のすべての群に比べ有意に少なかった（Candida陽性：66/107例、P=.013、A+D+群と比較、P=.005、A+D-群と比較、P=.002、Candida過剰増殖：15/107例、P<.001、他の全群と比較。図1）

カンジダ過繁殖の定義について異なるカットオフ（103、104、106、107 cfu/mL stool）を用いた探索分析では、定性的には同様の結果が得られました。 すべての計算において，Candidaの過剰増殖はA-D-群で他のすべての群より有意に少なかった。 C. albicansが最も多く（395例中216例），次いでC. glabrata（395例中104例），C. tropicalis（395例中21例），C. krusei（395例中11例），その他のCandida種（395例中97例）であった． Candidaの混合培養は395人中122人（31％）に認められた． スライド塗抹標本上の酵母数は培養液からの菌数と相関がなかった（r=.27、図2）