Langdurige verbetering van skeletspiermassa en -kracht door enkelvoudige gentoediening van myostatineremmers

Resultaten en Discussie

AAV-gemedieerde gentoediening aan spieren biedt een systeem om hoge eiwitniveaus te genereren in het doelweefsel of door een gesecreteerd product dat via de circulatie naar afgelegen plaatsen wordt vervoerd (19). We kloneerden de bekende gesecreteerde myostatine-remmende genen, waaronder groei en differentiatiefactor-geassocieerde serum proteïne-1 (GASP-1) (18), follistatine-gerelateerd gen (FLRG) (17), en follistatine-344 (FS) (13) in AAV serotype 1, die hebben aangetoond een hoge spier transductie mogelijkheden. Er zijn twee isovormen van follistatine gegenereerd door alternatieve splicing. De FS-344 variant ondergaat peptide splitsing van de FS-315 isovorm te genereren en de andere FS-317 variant produceert de FS-288 isovorm na peptide splitsing. We gebruikten de menselijke FS-344 variant, die uitsluitend genereert het serum circulerende FS-315 isovorm van FS en omvat een C-terminale zure regio (20). We kozen FS-344 (FS), omdat de andere FS-317 isovorm, het ontbreken van de C-terminus, toont preferentiële lokalisatie naar de eierstok folliculaire vloeistof en een hoge weefselbinding affiniteit via heparine sulfaat proteoglycanen, die van invloed kunnen zijn voortplantingscapaciteit en binden aan andere off-target sites (21). FS-288 vertegenwoordigt de membraan-gebonden vorm van follistatine (22), is een krachtige onderdrukker van hypofyse follikel stimulerend hormoon (23), wordt gevonden in de follikelvloeistof van de eierstok en in de testes, en toont een hoge affiniteit voor de granulosa cellen van de eierstok.

We zochten naar de werkzaamheid van deze eiwitten om spiermassa te verhogen in normale en dystrofische muizen te bepalen. We dienden 1 × 1011 AAV1 virale deeltjes per dier coderen FS, FLRG, GASP-1, of GFP bilateraal in de quadriceps en tibialis anterior spieren van 4-week-oude wild-type C57BL / 6 muizen. Alle dieren behandeld met de myostatine remmers toonden een toename van de lichaamsmassa met een waarneembare bruto verbetering van de spieren bij analyse op 725-dagen leeftijd in vergelijking met GFP-behandelde controles (Fig. 1 a en b). Evaluatie van de individuele spier gewichten toonde een toename van de spiermassa voor alle myostatine-remmer behandelde dieren, met de grootste stijging in FS-behandelde dieren. De toegenomen spiermassa werd gevonden in de geïnjecteerde achterpoot spieren en spieren op afstand van de injectieplaats, zoals de triceps. Deze remmers werden dus uitgescheiden in de circulatie vanaf de plaats van injectie, waardoor de skeletspiermassa op afgelegen plaatsen toenam (Fig. 1 c). De toename van de spiermassa ging gepaard met een functionele verbetering, aangetoond door een toename van de grijpkracht in de achterste ledematen (fig. 1 d). Er was geen effect op de hartmassa of de histologische verschijning van cardiomyocyten, wat erop wijst dat de remming van myostatine selectief was voor het skeletspierweefsel (gegevens niet aangetoond). Er is bezorgdheid dat FS nadelige effecten heeft op de gonadale functie. We vonden geen verandering in de reproductieve capaciteit in muizen behandeld met onze AAV1 met de FS344 transgen (AAV1-FS, tabel 1) Verder vonden we geen histologische / pathologische veranderingen in de gonadale weefsel van FS behandelde muizen in vergelijking met controles (data not shown).

Gezien de robuuste effecten van FS levering, testten we vervolgens het potentieel voor AAV1-FS postnataal geleverd in een klinisch zinvolle paradigma om spiermassa en kracht te verhogen en spierafbraak te vertragen in de mdx muis model van Duchenne spierdystrofie (DMD). DMD is een X-gebonden recessieve ziekte die leidt tot spieratrofie van het skelet en de hartfunctie, wat uiteindelijk resulteert in de dood. Recent werd FS onderzocht in mdx dieren die een gedupliceerd domein van het follistatine gen overexpresseren. De resultaten toonden een toename van de spiermassa en een verzwakking van de pathologie, hoewel de resultaten slechts gedocumenteerd waren tot 15 weken leeftijd (24). In onze studies, werden mdx dieren bilateraal geïnjecteerd in de quadriceps en tibialis anterior spieren met een lage (1 × 1010 virale deeltjes) of hoge dosis (1 × 1011 virale deeltjes) van AAV1-FS op 3 weken leeftijd en gevolgd gedurende 5 maanden voor necropsie. Verhoogde niveaus van circulerende FS werden gedetecteerd in het serum van zowel lage als hoge dosis behandelde dieren met de hoge dosis uitdrukken van de grootste niveaus van serum gedetecteerd FS (hoge dosis, 15,3 ± 2,1 ng / ml; lage dosis, 6,8 ± 0,4 ng / ml; GFP controles, 0 ± 0,1 ng / ml; n = 8 per groep; P < 0,01). We toonden aan dat AAV1-FS verhoogde lichaamsmassa in vergelijking met GFP behandelde controles, met de grootste stijging in de hoge dosis FS groep (data niet weergegeven). Bruto observatie van AAV1-FS behandelde muizen toonde een significante toename van de spiermassa in vergelijking met AAV1-GFP behandelde dieren (Fig. 2 a), met de grootste individuele toename van het spiergewicht in hoge dosis FS-behandelde dieren (Fig. 2 b). Effecten waren niet beperkt tot de geïnjecteerde spieren, ze werden ook gevonden op plaatsen op afstand van direct gerichte spieren (Fig. 2 b). Verhoogde spiermassa vertaald naar een dosis-afhankelijke verbetering van de spierkracht in de achterste ledematen en voorste ledematen van de behandelde dieren in vergelijking met GFP behandelde controles (Fig. 2 c). Histologische en morfometrische analyses van met AAV1-FS geïnjecteerde spieren en op afgelegen plaatsen toonden myofiberhypertrofie aan, wat de grove waarnemingen bij de necropsie ondersteunde (Fig. 3 a-c). Bovendien was er geen verschuiving in spiervezeltypes in AAV-FS behandelde dieren; echter, er waren minder totale vezels per vierkante millimeter in de tibialis anterior spier in dieren behandeld met de hoge dosis AAV-FS (Fig. 3 d en e). Opvallend, FS-behandelde muizen toonde een significante vermindering van serum creatine kinase in vergelijking met GFP-behandelde controles (Fig. 4 a). Dit is van belang, omdat FS was beschermend ondanks het ontbreken van correctie van de onderliggende dystrofine deficiëntie. Het exacte mechanisme is niet duidelijk, maar men zou kunnen speculeren dat het verhogen van de sterkte van individuele vezels hen minder vatbaar maakt voor schade door de stress van normale activiteiten. De betrokkenheid van satellietcellen in postnatale myostatine remming moet nog volledig worden opgelost, maar we zagen geen statistische verandering in spier satellietcellen markers voor FS-behandelde dieren (data not shown).

We evalueerden ook het potentieel voor AAV1-FS om spierkracht in mdx dieren te verhogen wanneer ze op oudere leeftijd werden behandeld. We vonden dat AAV1-FS injectie op 210 dagen leeftijd de spierkracht ≈60 dagen na toediening verhoogde en dat de verhoogde kracht langdurig aanhield gedurende de 560 dagen geëvalueerd in deze studie (Fig. 4 b). Al op 180 dagen leeftijd, vóór AAV1-FS behandeling, was er duidelijke pathologie in spieren van onbehandelde mdx dieren, met prominente endomysiale bindweefsel proliferatie en ontsteking (Fig. 4 c en d). Pathologische evaluatie van gastrocnemius en middenrif spieren op 560 dagen leeftijd toonde aan dat met AAV1-FS behandelde dieren aanzienlijk minder focale groepen van necrotische spiervezels en mononucleaire cel infiltraten hadden. Belangrijk is, AAV1-FS behandelde dieren hadden aanzienlijk minder focale gebieden van endomysial bindweefsel proliferatie, die werden uitgesproken in GFP behandelde dieren, waaruit blijkt dat fibrose, een kenmerk van spierdystrofie, werd verminderd in FS-behandelde dieren (Fig. 4 c). Pathologie in het middenrif toonde ook aan dat FS-behandeling ontsteking en vettige vervanging verminderd in vergelijking met GFP-behandelde dieren (Fig. 4 d). Bovendien AAV1-FS behandeling aangetoond significante toename van spiervezels diameters op deze leeftijd in vergelijking met controle GFP-behandelde dieren (Fig. 4 c en d). Deze resultaten toonden aan dat myostatine remming door FS behandeling gunstig was in de oude mdx dieren die meerdere rondes van spier degeneratie en regeneratie had ondergaan. Vertaling naar een klinische parallel suggereert dat AAV-gemedieerde FS gentherapie potentieel zou kunnen hebben voor de oudere DMD patiënt onafhankelijk van het vervangen van het ontbrekende gen en kan een potentiële rol in combinatietherapie vergelijkbaar met die aangetoond voor IGF-1 en minidystrophin gen vervanging (25).

Deze resultaten suggereren dat remming van myostatine door FS-344, geleverd door een enkele AAV1 injectie kan spiergrootte en kracht te verbeteren en wordt goed verdragen voor >2-jaar. De resultaten van FS344 kan bieden een krachtiger strategie dan anderen gericht alleen myostatine als gevolg van additieve effecten, zoals follistatine’s betrokkenheid bij meerdere signaalwegen, en de recente bevinding aantonen van een vermindering van de ontsteking in een model van endotoxemie (15, 26). Het opvallende vermogen van FS om bruto en functionele verbetering op lange termijn te bieden aan dystrofische spieren in oudere dieren rechtvaardigt de overweging voor klinische ontwikkeling voor de behandeling van spier-en skeletaandoeningen, met inbegrip van oudere DMD-patiënten.