Role of Candida in Antibiotic-Associated Diarrhea

Abstract

Om de rol van Candida species in antibioticageassocieerde diarree (AAD) kwantitatief te beoordelen, werden ontlastingmonsters van in totaal 395 patiënten en controlepersonen gekweekt in een differentieel isolatiemedium: 98 patiënten hadden AAD, 93 patiënten gebruikten antibiotica maar hadden geen diarree (A+D-), 97 patiënten gebruikten geen antibiotica maar hadden wel diarree (A-D+), en 107 patiënten waren controlepersonen (A-D-). Bovendien werd de productie van secreted aspartyl proteinase (Sap) getest. Bij AAD-patiënten verschilden de Candida-positiviteit (77/98) en Candida-overgroei (62/98) niet van die bij A+D- patiënten (75/93 en 52/93 , respectievelijk). Candida overgroei bij A-D+ patiënten (40/97, P=.003) was minder frequent dan bij AAD patiënten, maar Candida positiviteit was niet verschillend (80/97, P=.612). Bij de controlepersonen kwamen Candida positiviteit en overgroei minder vaak voor dan in alle andere groepen. De productie van Sap verschilde niet tussen patiënten met AAD en controlepersonen (P=.568 en P=.590, respectievelijk). De gegevens wijzen erop dat verhoogde Candida-tellingen eerder een gevolg zijn van antibioticabehandeling of diarree dan een oorzaak van AAD

Orale spruw en slokdarmontsteking zijn de meest voorkomende pathologische manifestaties van Candida-infecties . De rol van Candida in antibiotica-geassocieerde diarree (AAD) is omstreden. Fecale concentraties van Candida-soorten van ⩾105 kve/mL ontlasting zijn beschouwd als de oorzaak van diarree bij patiënten na een antibioticakuur. Er is gerapporteerd dat patiënten die antibiotica kregen zonder diarree te ontwikkelen <105 kve Candida-fungi/mL ontlasting hadden

Secreted aspartyl proteinases (Saps) zijn belangrijke virulentiefactoren die door Candida-soorten worden geproduceerd. Saps zijn betrokken bij de aanhechting van Candida albicans aan menselijke mucosa en bij de invasie van menselijk weefsel. Een correlatie tussen de expressie van Saps en de virulentie van Candida is aangetoond bij orale candidiasis en Candida vaginitis bij patiënten die besmet zijn met het humane immunodeficiëntievirus (HIV). In Candida-gerelateerde AAD is actieve secretie gemedieerd door een schimmeltoxine of toxine-achtige stoffen besproken als het pathogenetisch mechanisme voor diarree. In C. albicans zijn 10 verschillende SAP genen geïdentificeerd. In Candida tropicalis is een zwakke extracellulaire proteolytische activiteit waargenomen, terwijl Candida glabrata geen proteolytische activiteit heeft op eiwitagar

C. albicans is bekend om de productie van aspartyl proteïnasen wanneer gekweekt in een medium met eiwit als de enige bron van stikstof , en expressie van het SAP2 gen is voornamelijk verantwoordelijk voor de proteolytische activiteit waargenomen in de meeste stammen die groeien in de gistvorm in vitro . Saps vertoont ook proteolytische activiteit in het maagdarmkanaal; de expressie van SAP in orale candidiasis en de afbraak van gastro-intestinale mucine door Saps zijn aangetoond. De afbraak van gastro-intestinale mucine door enzymen is geïmpliceerd als een virulentiebepalende factor voor een aantal enteropathogenen (b.v. Vibrio cholerae, Shigella species, Helicobacter pylori en Yersinia enterocolitica). Voor C. albicans, die mucosale oppervlakken koloniseert, kan mucine-afbraak door SAP2 een betere benadering van epitheliale cellen en/of wijziging van celoppervlakken mogelijk maken. Hogere niveaus van secretorisch Candida zuur proteïnase werden gevonden bij kinderen met acute en chronische diarree dan bij gezonde controlepersonen

Om de pathogenetische relevantie van Candida soorten bij volwassen patiënten met AAD op te helderen, hebben we kwantitatieve ontlastingkweken voor Candida soorten uitgevoerd bij 395 immunocompetente volwassenen. Bovendien werd de productie van Saps onderzocht

Methodieken

Patiëntenselectie en verzameling van ontlastingmonstersAlle patiënten op een 250 bedden tellende medische afdeling werden gedurende 11 maanden dagelijks onderzocht op diarree of op behandeling met antibiotica bij afwezigheid van diarree. Diarree werd gedefinieerd als >3 papperige of waterige ontlasting per dag. Antibioticabehandeling werd gedefinieerd als het ontvangen van orale of intraveneuze antibiotica in therapeutische doses gedurende ⩾1 dag. AAD werd gedefinieerd als >3 papperige of waterige ontlasting per dag tijdens of tot 2 maanden na de antibioticabehandeling . Patiënten werden achtereenvolgens gerekruteerd in 4 studiegroepen tot de vooraf bepaalde aantallen nodig voor statistische vergelijking werden bereikt (zie statistische analyse hieronder). Patiënten werden slechts eenmaal geïncludeerd tijdens hun ziekenhuisopname

Stoolmonsters van alle patiënten met diarree werden gekweekt voor bacteriële pathogenen (salmonella, shigella, yersinia, en campylobacter) op selectieve agar, werden onderzocht op eicellen en parasieten, en werden getest op Clostridium difficile door kweek op selectieve agar en door gebruik van de snelle C. difficile test (BD). Patiënten met een van deze pathogenen werden van het onderzoek uitgesloten. Aldus werden 395 patiënten (195 met diarree en 200 zonder) in de studie opgenomen en in 4 groepen ingedeeld: (1) groep A+D+, 98 AAD patiënten die antibiotica kregen en diarree ervoeren; (2) groep A+D-, 93 patiënten die antibiotica kregen maar geen diarree ervoeren; (3) groep A-D+, 97 patiënten die geen antibiotica kregen maar wel diarree ervoeren; en (4) groep A-D-, 107 controlepersonen die geen antibiotica kregen en geen diarree ervoeren

De 4 groepen verschilden niet in geslacht en leeftijdsverdeling. Ontlastingmonsters van alle proefpersonen werden direct na een stoelgang verzameld en binnen 15 min. naar het laboratorium in hetzelfde gebouw gebracht. Monsters van ’s nachts gepasseerde ontlasting werden bewaard bij 4°C en werden de volgende ochtend verwerkt

Candida culturen en uitstrijkjesDe ontlasting monsters werden 1:10 verdund met een zoutoplossing, werden geroerd in een ontlasting homogenisator, en opnieuw 1:1000 en 1:10000 verdund met een zoutoplossing. Honderd microliter van elke verdunning werd overgebracht op een Candida CHROMagar (BBL) en gelijkmatig uitgezet met een steriel wattenstaafje. Na incubatie bij 37°C gedurende 48 uur in omgevingslucht werden de Candida-kolonies geteld en geclassificeerd als C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis of andere Candida-soorten, afhankelijk van de kleur van de kolonies. Een kolonietelling ⩾105 kve/mL ontlasting werd geclassificeerd als “Candida overgroei”, volgens Danna et al. Een objectglaasje van elke verdunning van de eerste 100 opeenvolgende ontlastingmonsters werd gekleurd met Gram’s kleuring en werd met lichtmicroscopie onderzocht op de aanwezigheid van gisten en leukocyten

Detectie van SapsConsecutive Candida-isolaten van patiëntengroepen A-D- en A+D+ werden getest op aspartylproteïnase-afscheiding in boviene serumalbumine (BSA) agar (1,17% gistkoolstofbasis , 0,01% gistextract , en 0,2% BSA ), zoals elders beschreven . Het medium werd op pH 5,0 gebracht, gesteriliseerd door filtratie (poriegrootte, 0,2 μm), en toegevoegd aan een voorraadoplossing van geautoclaveerde (2%) agar. De proteolyse, die de enzymactiviteit aangeeft, werd gemeten in millimeters en gescoord zoals elders voorgesteld: – of ± (geen zichtbare of een zeer beperkte klaring van de agar rond de kolonie), 1+ (merkbare proteolyse werd waargenomen), en 2+ (klaring van de agar overschreed ruimschoots de rand van de kolonie). C. albicans stam SC5314 en een SAP2 null mutant (geleverd door B. Hube, Universiteit van Hamburg, Duitsland) werden onderzocht als controles

Statistische analyseHet aantal patiënten met verschillende Candida-tellingen in verschillende groepen werd vergeleken met behulp van de χ2-test, en gisttellingen op objectglaasjes werden gecorreleerd met de Candida-tellingen uit kweken met behulp van Pearson’s correlatie. Verschillen in Sap-productie werden berekend met behulp van Student’s t en Fisher’s exact tests. De steekproefgrootte voor de kweektest werd berekend als 91 evalueerbare patiënten, en voor de Sap-test werd deze berekend als 20 evalueerbare patiënten per groep, met een α van .05 en een power van 0.8 (SigmaStat, versie 2.0; Jandel Scientific). Verschillen met P<.05 werden als significant beschouwd

Resultaten

Candida kweken en objectglaasjesuitstrijkjesDe resultaten van de Candida kweken zijn weergegeven in figuur 1. In groep A+D+ waren de Candida-positiviteit (bij 77/98 patiënten) en de Candida-overgroei (bij 62/98 patiënten) niet significant verschillend van die in groep A+D- (75/93 patiënten en 52/93 patiënten , respectievelijk). In groep A-D+ kwam Candida overgroei significant minder vaak voor dan in groep A+D+ (P=.003), maar Candida positiviteit was niet significant verschillend (P=.612). Candida positiviteit en overgroei kwamen significant minder vaak voor in groep A-D- dan in alle andere groepen (Candida positiviteit: 66/107 patiënten, P=.013, vergeleken met groep A+D+; P=.005, vergeleken met groep A+D-; en P=.002, vergeleken met groep A-D+; Candida overgroei: 15/107 patiënten, P<.001, vergeleken met alle andere groepen; figuur 1)

Exploratieve analyses met verschillende cutoffs voor de definitie van Candida-overgroei (103, 104, 106 of 107 cfu/mL ontlasting) leverden kwalitatief vergelijkbare resultaten op. In alle berekeningen kwam Candida overgroei significant minder vaak voor in groep A-D- dan in alle andere groepen. C. albicans was het meest frequente isolaat (216 van 395 patiënten), gevolgd door C. glabrata (104 van 395 patiënten), C. tropicalis (21 van 395 patiënten), C. krusei (11 van 395 patiënten), en andere Candida-soorten (97 van 395 patiënten). Gemengde Candida-culturen werden aangetroffen bij 122 (31%) van 395 patiënten. Gisttellingen op objectglaasjes correleerden niet met tellingen uit kweken (r=.27; figuur 2)

Proteolytische activiteit op BSA-agarOver het geheel genomen werden 23 A+D+ en 20 A-D-Candida-isolaten getest op proteolytische activiteit in BSA-agar. De gemiddelde±SD-activiteit bedroeg 1,26±1,06 mm voor de A+D+-groep en 1,42±0,64 mm voor de A-D-groep. Van de 23 A+D+ isolaten hadden er 16 een proteolyse-score van 1+ (klaringszone van 1-2 mm) en 1 had een score van 2+ (klaringszone van 3-5 mm), beide duidend op de aanwezigheid van protease-enzymactiviteit. Van de 20 A-D-isolaten hadden er 17 een proteolyse-score van 1+ en 2 een score van 2+. Alle C. albicans-isolaten vertoonden klaringszones op BSA-medium (⩾1 mm, ⩾1+ score). In groep A-D-, vertoonde 1 C. tropicalis isolaat geen proteolyse. In groep A+D+ vertoonden 5 C. glabrata isolaten en 1 C. tropicalis isolaat geen proteolyse. De klaringszones van groep A-D- en A+D+ waren niet significant verschillend, gemeten in millimeters (P=.568, Student’s t-test) of met het 1+/2+ scoresysteem (P=.294 en P=.590 voor isolaten die respectievelijk 1+ en 2+ scoorden, Fisher’s exact test). Wanneer C. glabrata isolaten (waarvan bekend is dat ze negatief zijn op proteïne agar) werden verwijderd, was er geen significant verschil in Sap productie tussen de groepen (P=.347)

Discussie

Candida overgroei is verondersteld AAD te veroorzaken . Wij onderzochten de aanwezigheid en hoeveelheid van Candida soorten bij patiënten die verdacht werden van het hebben van AAD, patiënten zonder diarree maar die antibiotica gebruikten, patiënten met diarree maar die geen antibiotica gebruikten, en patiënten zonder diarree en die geen antibiotica gebruikten (controlepersonen). Een significant hoger percentage ontlastingmonsters van patiënten die een antimicrobiële therapie kregen en diarree hadden (A+D+ groep) was positief voor Candida-soorten en had een hoger koloniegetal dan monsters van controlepersonen (A-D-groep). In een studie van Danna et al. werd Candida overgroei (⩾105 kve/mL ontlasting) gezien bij 7 (29%) van 24 AAD patiënten. In die studie hadden 0 van 24 patiënten zonder diarree maar die antibiotica kregen Candida overgroei. In onze studie echter, hadden 52 (56%) van 93 patiënten met antibiotica maar zonder diarree Candida overgroei, en er werd geen verschil gezien, vergeleken met AAD patiënten. Aangezien wij een bijna 4-voudig aantal patiënten onderzochten (93 vs. 24), kunnen de verschillen tussen onze bevindingen en die van Danna et al. te wijten zijn aan de grotere steekproefgrootte in onze studie

Om de invloed van diarree op intestinale Candida-tellingen te beoordelen, onderzochten wij ook patiënten die geen antibioticatherapie kregen maar wel diarree hadden (groep A-D+). In deze groep kwam Candida overgroei (⩾105 kve/mL ontlasting) significant minder vaak voor dan bij AAD patiënten, maar Candida positiviteit was niet significant verschillend. Eerdere studies toonden aan dat de normale flora van de ontlasting duidelijk verlaagd was bij AAD patiënten. In studies waarin de effecten van breedspectrumantibiotica op de samenstelling van de intestinale microflora van mensen werden onderzocht, werd een significante omgekeerde correlatie waargenomen tussen de log van de maximale toename in gisten en de log van de maximale afname in anaërobe bacteriën. Aangezien we een verhoogde Candida-positiviteit vonden bij AAD-patiënten, A+D- patiënten en A-D+ patiënten, suggereren we dat de afname van bacteriën in de ontlasting, als gevolg van ofwel antibioticatherapie of verdunning bij diarree, Candida-soorten de kans gaf zich uit te breiden, wat resulteerde in een verhoogd aantal Candida-positieven

In onze studie correleerden de gemiddelde gisttellingen op uitstrijkjes gekleurd met Gram’s kleuring niet met Candida-culturen wanneer berekend met ofwel het totale aantal gisten op uitstrijkjes (r=.27) of met de door Danna et al. voorgestelde index (r=.12). De discrepantie tussen grote aantallen onder een lichtmicroscoop getelde gistachtige cellen en de geringe of afwezige groei van Candida-soorten is elders gemeld 15]. In die studie veronderstelden de auteurs dat een grote meerderheid van de onder de microscoop waargenomen gisten in ontlasting niet levend was. Onze resultaten geven aan dat grote voorzichtigheid moet worden betracht bij het interpreteren van ontlastingmonsters van patiënten met AAD die positief zijn voor Candida-soorten. Het nut van het analyseren van ontlasting op Candida-tellingen door middel van kweek of uitstrijkjes bij deze patiënten wordt ernstig in twijfel getrokken. De afwezigheid van leukocyten in monsters gekleurd met Gram’s kleuring was consistent met eerdere bevindingen. Onze resultaten bevestigden ook dat Candida soorten deel uitmaakten van de normale darmflora

Actieve secretie gemedieerd door een schimmel toxine of toxine-achtige stoffen is besproken als het mechanisme voor Candida gerelateerde AAD . Aangezien Saps de belangrijkste virulentiefactoren zijn in Candida infecties , hebben wij deze proteïnasen in vitro onderzocht. Tot op heden zijn er 10 verschillende SAP genen geïdentificeerd in C. albicans . Omdat SAP heeft bijgedragen tot weefselschade in een model van humane orale candidose , kunnen deze proteinasen ook schade toebrengen aan intestinale epitheliale cellen. Maar bij 8 patiënten die verdacht werden van candida-gerelateerde AAD, waren er geen aanwijzingen voor colitis of cellulaire schade

In onze studie produceerden alle onderzochte C. albicans-stammen Sap, en er was geen significant verschil tussen de hoeveelheid geproduceerd Sap in Candida-isolaten van AAD-patiënten en controlepersonen. Hogere niveaus van secretorische Candida zure proteïnases werden gevonden bij kinderen met acute en chronische diarree dan bij gezonde controlepersonen. Hoewel de Sap-niveaus berekend voor de hele groep kinderen met acute of chronische diarree significant hoger waren dan de niveaus bij controlepersonen, was dit niet het geval in afzonderlijke gevallen. Van 9 Candida isolaten, hadden 4 van controlepersonen (kinderen zonder diarree) Sap niveaus vergelijkbaar met die van kinderen met chronische diarree, en 2 van de 9 controlepersonen hadden niveaus vergelijkbaar met die van kinderen met acute diarree. Ondanks deze hoge Sap-spiegels hadden de controlepersonen geen diarree. Dit staat in contrast met bevindingen in eerdere studies, waarin de Sap-productie bij symptomatische patiënten altijd hogere niveaus bereikte dan bij controlepersonen: De Sap-productie door Candida-soorten van vaginitis-patiënten was altijd hoger dan de Sap-productie door Candida van dragers, en Candida-stammen van orale candidiasis bij AIDS-patiënten produceerden ∼8-voudig meer Sap dan isolaten van controlepersonen

Sap-productie wordt coherent aangegeven door de BSA agar-test en ELISA . Bovendien correleerden de hoge niveaus van Sap die in vitro werden afgescheiden en door BSA agar of ELISA werden gedetecteerd, met verhoogde niveaus van Sap in vivo (b.v. in vaginale vloeistoffen van HIV-positieve vaginitispatiënten) . Men kan speculeren dat Candida species tijdelijk hoge niveaus Sap produceert in vivo maar dit vermogen verliest door bijvoorbeeld subcultuur. Bij C. albicans geïsoleerd uit mondholten werd aangetoond dat een verhoogde Sap-productie een stabiel kenmerk was. Anderzijds vertoonden C. albicans isolaten met een lage proteïnase productie een stabiele, lage Sap productie bij herhaalde subculturen

Samenvattend bevestigen de resultaten van onze studie niet de eerder gesuggereerde pathogenetische mechanismen van Candida gerelateerde AAD . Onze gegevens wijzen erop dat verhoogde Candida-tellingen eerder een gevolg zijn van antibioticabehandeling of diarree dan een oorzaak van AAD. De productie van de belangrijkste virulentiefactor van de schimmel Sap bij patiënten met AAD verschilde niet van die bij controlepersonen, wat erop wijst dat dit schimmeltoxine mogelijk niet verantwoordelijk is voor AAD bij volwassenen. Andere schimmelvirulentiefactoren (bv. phospholipases) warrant further investigation