Bestämning av V617F-mutationen i JAK2-genen vid kroniska myeloproliferativa syndrom i vårt land: en fallrapport
Bestämning av V617F-mutationen i JAK2-genen vid kroniska myeloproliferativa syndrom i vårt land: en fallrapport
Dr Daniela Lens*, Pablo Muxi†, Lics. Andreína Brugnini‡,
Natalia Trías‡, Dra. Silvia Pierri§
Hospital de Clínicas. Medicinska fakulteten.
Republikens universitet. Montevideo, Uruguay
Abstrakt
Polycytemia vera (PV), essentiell trombocytemi (ET) och idiopatisk myelofibros (IM) är nära besläktade klonala myeloproliferativa sjukdomar som kännetecknas av överdriven proliferation av en eller flera myeloida linjer som erytrocyter, trombocyter och fibroblaster i benmärgen. Även om det finns strikta kriterier för diagnosen av dessa myeloproliferativa syndrom är den exakta kategoriseringen fortfarande omdiskuterad, och dessutom är dessa sjukdomar i många fall svåra att skilja från reaktiva processer.
Redan 2005 identifierades en mutation i tyrosinkinasgenen Janus kinas 2 (JAK2) i flera av dessa enheter. Mutationen innebär att ett G byts ut mot ett T i position 1849, vilket leder till att ett fenylalanin byts ut mot ett valin i proteinet (JAK2 V617F).
Förekomsten av denna mutation observerades i cirka 90 % av fallen med PV och i cirka 50 % av fallen med IM och ET.
I denna artikel kommer vi att beskriva upptäckten av denna mutation hos en patient med diagnosen trolig PV med hjälp av en mycket känslig allelspecifik polymeraskedjereaktionsanalys (PCR) för upptäckt av denna mutation och diskutera betydelsen av denna nyupptäckta mutation för diagnos och behandling av BCR-ABL-negativa myeloproliferativa syndrom.
Nyckelord: MYELOPROLIFERATIVA SORTIGHETER – diagnos.
MUTATION – genetik.
PROTEIN-TYROSIN KINASE.
* Docent. Grundläggande medicinska institutionen.
† Docent. Hematologiklinik. Klinisk avdelning för medicin.
‡ Biokemi Lic. Assistent. Grundläggande medicinska institutionen.
§ Docent. Hematologiklinik. Klinisk avdelning för medicin.
Korrespondens: Dr Daniela Lens.
Avdelningen. Grundläggande medicin. Hospital de Clínicas. Piso 15. Avda Italia s/n. Montevideo CP 11600. Montevideo, Uruguay.
E-post: [email protected]
Inkom: 31/7/06.
Antagen: 26/2/07.
Introduktion
I motsats till kronisk myeloisk leukemi där identifieringen av det specifika BCR-ABL-rearrangemanget ledde till ett genombrott för diagnos, övervakning och behandling av denna enhet, I BCR-ABL-negativa kroniska myeloproliferativa syndrom (PMS), såsom polycytemia vera (PV), essentiell trombocytemi (ET) och idiopatisk myelofibros (IM), var inga specifika genetiska förändringar kända förrän helt nyligen.
Mellan maj och juni 2005 beskrev fem forskargrupper en ny punktmutation i JAK2-genen för tyrosinkinas, som beror på att ett guanin byts ut mot ett tymin vid nukleotid 1849 i exon 14, vilket resulterar i att ett valin byts ut mot ett fenylalanin vid position 617 i proteinet, och som ger JAK2-mutationen namnet V617F(1-5).
Denna mutation observerades i cirka 90 procent av fallen med PV när högkänsliga tester används för att upptäcka den(6). Den hittades också i cirka 50 % av fallen med IM och ET, medan den inte har hittats hos friska personer eller hos patienter med sekundär erytrocytos, så denna mutation har ett mycket högt prediktivt värde för att skilja SMPC från icke-klonala tillstånd som sekundär polycytemi.
Denna mutation förekommer i en mycket konserverad region i en autoinhibitorisk domän som negativt reglerar JAK2-signalering. Flera studier har visat att denna mutation är inblandad i patogenesen för dessa tillstånd, särskilt på grund av en funktionsökning av JAK2-genen och en kontrollförlust som är förknippade med den överdrivna myeloproliferationen vid dessa sjukdomar.
I denna artikel kommer vi att beskriva upptäckten av denna mutation hos en patient med diagnosen trolig PV och diskutera betydelsen av denna nya mutation för diagnos och behandling av BCR-ABL-negativa SMP.
Material och metod
Extraktion av desoxyribonukleinsyra
Genomisk desoxyribonukleinsyra (DNA) extraherades från 1 ml citraterat perifert blod med hjälp av det kommersiella reagenset dnazol (Life Techno-logies) och enligt det protokoll som anges av tillverkaren. DNA-proverna förvarades vid 4 °C.
Detektion av Vl617F-mutationen
V617F-mutationen detekterades från tidigare erhållet genomiskt DNA genom allelspecifik polymeraskedjereaktion (PCR) enligt den metod som publicerats av Baxter et al(1). Denna PCR är utformad för att använda tre olika primers, kallade JAK2R, JAK2F/IC och JAK2F (tabell 1). JAK2F-primern är specifik för den muterade allelen och JAK2F/IC-primern finns hos alla individer oavsett om mutationen finns eller inte, vilket utgör en intern kontroll av reaktionen. Hos alla individer amplifieras således en produkt på 364 baspar (bp) med JAK2F/IC- och JAK2R-principerna, och endast hos individer med den studerade mutationen erhålls en produkt på 203 bp med JAK2F- och JAK2R-principerna (figur 1).
PCR-amplifiering utfördes i en slutvolym på 20 uL med hjälp av 500 ng DNA, 200 mM/L av varje dNTP, 0,5 U Taq-polymeras (New England Biolabs) och 2 uL 10x Taq-buffert innehållande 2 mM MgCl (New England Biolabs), 0,5 mM av JAK2 F- och JAK2 F/IC-primers och 1 mM av JAK2 R-primer.
Det PCR-program som används består av 36 cykler, som börjar med en denaturering på 5 minuter, sedan cyklande: 30 sekunder vid 94 °C, 30 sekunder vid 58 °C och 30 sekunder vid 72 °C, och avslutas med en sista förlängning på 5 minuter. En negativ kontroll som innehåller alla reagenser som krävs för amplifiering och där DNA-mallen ersätts med vatten ingår alltid i alla reaktioner. Verifiering av den förväntade PCR-produkten utfördes på en 2 % agarosgel färgad med etidiumbromid(7).
Fallanalys
Manlig patient, 72 år gammal, storrökare, med kronisk arteriell hypertoni under behandling och bärare av en kronisk obstruktiv arteriopati som 2002 bestämde sig för att amputera den femte tån på vänster fot. I december 2004, med en ny obstruktiv episod i vänster nedre extremitet, visade hans hemogram en ökning av antalet röda blodkroppar med en hematokrit på 66 %, tillsammans med en granulocytos på 24 000 och trombocyter på 245 000. Hematokriten förblev oförändrad och antalet blodplättar ökade successivt till 710 000. I benmärgsbiopsiundersökningen observerades en hypercellulär benmärg med hyperplasi av de erytroida serierna, vilket ledde till slutsatsen att det rörde sig om ett kroniskt myeloproliferativt syndrom av PV-typ.
Patienten behandlades med flebotomier och började i maj 2005 behandling med hydroxyurea, som avbröts i februari 2006 på grund av en blödningskomplikation.
Som framgår av figur 2 uppvisade patienten ett mönster med två band i den allelspecifika PCR-undersökningen för V617F-mutationen i JAK2-genen. Å ena sidan finns kontrollbandet på 364 bp som också finns i de två undersökta friska kontrollerna. Å andra sidan amplifierades också en produkt på 203 bp hos patienten som visade att mutationen fanns. Detta band observerades inte hos de friska kontrollerna.
Diskussion och slutsatser
I detta arbete har vi beskrivit det första fallet där V617-mutationen i JAK2-genen har identifierats i vårt land. Detta arbete är en del av ett tvärvetenskapligt projekt mellan den medicinska grundutbildningen och hematologin vid Hospital de Clínicas, i syfte att fastställa förekomsten av denna mutation hos 100 patienter med BCR-ABL-negativa PMS.
Den nyligen gjorda identifieringen av den aktiverande V617F-mutationen i JAK2-genen utgör ett viktigt framsteg i kunskapen om patogenesen för BCR-ABL-negativa myeloproliferativa syndrom. På grund av den höga frekvensen av denna mutation i PV och i mindre utsträckning i ET och IM har det antagits att upptäckt av denna mutation skulle ha stor betydelse för diagnos, klassificering och behandling av dessa enheter. Olika grupper har föreslagit att man ska införa detektion av denna mutation som ett första diagnostiskt test när hematokriten är större än 51 % eller när man misstänker PV, med tanke på att detektion av JAK2 V617F har ett positivt prediktivt värde på 100 % för diagnosen PV(8,9). Å andra sidan har flera författare hävdat att närvaron av denna mutation skulle möjliggöra en ny klassificering av PMS, eftersom ET, PV och MI som bär på JAK2-mutationen skulle kunna representera samma sjukdom i olika utvecklingsstadier i stället för olika enheter(10-12). Det exakta kliniska värdet och nyttan av att upptäcka denna mutation återstår dock att fastställa och det krävs särskilt utformade prospektiva kliniska prövningar för att lösa dessa frågor.
Fyndet av denna mutation öppnar dessutom nya möjligheter för behandlingar som specifikt riktar sig mot det muterade proteinkinaset, i likhet med BCR-ABL-hämmare vid kronisk myeloisk leukemi.
Sammanfattning
Polycytemia vera (PV), essentiell trombocytemi (ET-TE) och idiopatisk myelofibros (IM-MI) är klonala myeloproliferativa sjukdomar som kännetecknas av en överdriven proliferation av en eller flera myeloida linjer såsom erytrocyter, trombocyter och fibroblaster i benmärgen.
Den exakta kategoriseringen av myeloproliferativa syndrom måste fortfarande diskuteras även om de diagnostiska kriterierna är strikta; dessutom är dessa sjukdomar svåra att skilja från reaktiva processer.
Nyligen, 2005, identifierades JAK2-mutation i många av dessa enheter. Sekvensering av den kodande delen av JAK2 avslöjade en G- till T-transversion vid position 1849, där valin ändrades till fenylalanin (JAK2 V617F).
Förekomsten av V617F-JAK2-mutationen var nästan 90 % hos patienter med PV och 50 % hos patienter med IM och ET.
I denna studie beskriver vi upptäckten av V617F-JAK2-mutationen hos en patient misstänkt för PV med hjälp av allelspecifik polymeraskedjereaktionsanalys (PCR) och vi diskuterar betydelsen av mutationen för diagnostik och behandling av negativa BCR-ABL myeloproliferativa syndrom.
Resumé
La polycytémie vera (PV), Essentiell trombocytemi (ET) och idiopatisk myelofibros (IM) är nära besläktade klonala myeloproliferativa sjukdomar som kännetecknas av överdriven proliferation av en eller flera myeloida linjer såsom erytrocyter, trombocyter och benmärgsfibroblaster. Även om det finns strikta kriterier för diagnosen av dessa myeloproliferativa syndrom förblir den exakta kategoriseringen en diskussionsfråga och dessutom är dessa sjukdomar svåra att skilja från reaktiva processer i flera fall.
Nyligen, 2005, identifierades en mutation i tyrosinkinasgenen Janus kinase 2 (JAK2) i flera av dessa enheter. Mutationen innebär att ett G byts ut mot ett T i position 1849, vilket leder till att fenylalanin byts ut mot valin i proteinet (JAK2 V617F).
Förekomsten av denna mutation har observerats i nästan 90 % av fallen med PV och i cirka 50 % av fallen med MI och TE.
I detta arbete kommer vi att beskriva upptäckten av denna mutation hos en patient med diagnosen trolig PV med hjälp av en allelspecifik polymeraskedjereaktion (PCR) med hög känslighet för upptäckt av denna mutation och diskutera betydelsen av denna nyupptäckta mutation i diagnos och behandling av BCR-ABL-negativa myeloproliferativa syndrom.
Resumo
Policitemia Vera (PV), trombocitemia hemorrágica (TE) och mielofibrose idiopática (MI) är transtornos mieloproliferativos clonais fortemente relacionados e caracterizados por uma proliferação excessiva de uma ou mais línhas mielóides tais como eritrócitos, platequetas e fibroblastos da medula óssea.
Embora existam critérios rigorososos para o diagnóstico destas síndromes mieloproliferativas, a classificação precisa continua sendo sendo discutida; ademais muitas vezes é muito difícil diferenciar estes distúrbios de processos reativos.
Under 2005 identifierades en mutation i genen tyrosinkinas Janus kinase 2 (JAK2) i flera av dessa enheter. I denna mutation observeras ett byte från G till T i position 1849, vilket leder till ett byte från fenylalanin till valin (JAK2 V617F) i proteinet.
Denna mutation observerades i cirka 90 % av fallen med PV och i cirka 50 % av fallen med MI och TE.
I denna artikel beskriver vi upptäckten av denna mutation hos en patient med en trolig diagnos av PV med hjälp av en mycket känslig allelspecifik polymeraskedjereaktionsanalys (PCR) för upptäckt av denna mutation och diskuterar betydelsen av denna nyupptäckta mutation för diagnos och behandling av BCR-ABL-negativa myeloproliferativa syndrom.
Bibliografi
1. Baxter EJ, Scott LM, Campbell PJ, East C, Fourouclas N, Swanton S, et al. Förvärvad mutation av tyrosinkinaset JAK2 vid myeloproliferativa sjukdomar hos människor. Lancet 2005; 365: 1054-61.
2. James C, Ugo V, Le Couedic JP, Staerk J, Delhommeau F, Layout C, et al. En unik klonal JAK2-mutation som leder till konstitutiv signalering orsakar polycythaemia vera. Nature 2005; 434: 1144-8.
3. Kralovics R, Passamonti F, Buser AS, Teo SS, Tiedt R, Passweg JR, et al. En funktionsökning i JAK2-mutationen hittas ofta hos patienter med myeloproliferativa sjukdomar. N Engl J Med 2005; 352: 1779-90.
4. Levine RL, Waldleigh M, Cools J, Ebert BL, Werning G, Huntly BJ, et al. Aktiverande mutation i tyrosinkinaset JAK2 i polycythaemia vera, essentiell trombocytemi och myeloisk metaplasi med myelofibros. Cancer Cell 2005; 7: 387-97.
6. Vainshenker W, Constantinescu SN. En unik aktiveringsmutation i JAK2 (V617F) ligger till grund för polycytemi Vera och möjliggör en ny klassificering av myeloproliferativa sjukdomar. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2005; 195-200.
7. Sambrook J, Russell DW. Molekylär kloning: en laboratoriehandbok. 3 ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 2001.
8. Tefferi A, Pardanani A. Mutationsscreening för JAK2V617F: när testet ska beställas och hur resultaten ska tolkas. Leuk Res 2006; 30(6): 739-44.
9. James C, Delhommeau F, Marzac C, Teyssandier I, Couedic JP, Giraudier S, et al. Detektion av JAK2 V617F som ett första diagnostiskt test för erytrocytos. Leukemia 2006; 20: 350-3.
10. Campbell PJ, Scott LM, Buck G, Wheatley K, East CL, Marsden JT, et al. Definition av subtyper av essentiell trombocytemi och relation till polycythaemia vera baserat på JAK2 V617F-mutationsstatus: en prospektiv studie. Lancet 2005; 366: 1945-53.
11. Antonioli E, Guglielmelli P, Pancrazzi A, Bogani C, Verrucci M, Ponziani V, et al. Kliniska implikationer av JAK2 V617F-mutationen vid essentiell trombocytemi. Leukemia 2005; 19: 1847-9.