Candida i antibiotikaassocierad diarré

Abstract

För att kvantitativt bedöma Candida-arternas roll i antibiotikaassocierad diarré odlades avföringsprover från totalt 395 patienter och kontrollpersoner i ett differentiellt isoleringsmedium: 98 patienter hade AAD, 93 patienter tog antibiotika men hade inte diarré (A+D-), 97 patienter tog inte antibiotika men hade diarré (A-D+) och 107 patienter var kontrollpersoner (A-D-). Dessutom testades produktionen av sekretat aspartylproteinas (Sap). Hos AAD-patienterna skilde sig inte Candida-positivitet (77/98) och Candida-överväxt (62/98) från A+D- patienterna (75/93 respektive 52/93). Candidaöverväxt bland A-D+-patienter (40/97, P=.003) var mindre vanligt än bland AAD-patienter, men Candidapositiviteten var inte annorlunda (80/97, P=.612). Hos kontrollpersoner var Candida-positivitet och överväxt mindre vanliga än i alla andra grupper. Produktionen av Sap skiljde sig inte mellan patienter med AAD och kontrollpersoner (P=.568 respektive P=.590). Data tyder på att förhöjda Candidaantal är ett resultat av antibiotikabehandling eller diarré snarare än en orsak till AAD

Oral tröst och esofagit är de vanligaste patologiska manifestationerna av Candida-infektioner . Candidas roll i antibiotikaassocierad diarré (AAD) har diskuterats . Fekala koncentrationer av Candida-arter på ⩾105 cfu/mL avföring har ansetts orsaka diarré hos patienter efter antibiotikabehandling. Det har rapporterats att patienter som fått antibiotika utan att utveckla diarré hade <105 cfu Candida svampar/mL avföring

Secreted aspartyl proteinases (Saps) är viktiga virulensfaktorer som produceras av Candida arter. Saps är involverade i Candida albicans’ vidhäftning till mänskliga slemhinnor och i invasionen av mänsklig vävnad. Ett samband mellan uttryck av Saps och Candida-virulens har påvisats vid oral candidiasis och Candida-vaginit hos HIV-infekterade patienter . Vid Candida-relaterad AAD har aktiv sekretion med hjälp av ett svamptoxin eller toxinliknande ämnen diskuterats som den patogenetiska mekanismen för diarré . I C. albicans har 10 olika SAP-gener identifierats . I Candida tropicalis har svag extracellulär proteolytisk aktivitet observerats, medan Candida glabrata inte har någon proteolytisk aktivitet på proteinagar

C. albicans är känd för att producera aspartylproteinaser när den odlas i medium med protein som enda kvävekälla , och uttrycket av SAP2-genen är huvudansvarig för den proteolytiska aktivitet som observeras i de flesta stammar som växer i jästform in vitro . Saps uppvisar också proteolytisk aktivitet i mag-tarmkanalen; SAP-uttryck vid oral candidiasis och nedbrytning av gastrointestinal mucin av Saps har påvisats . Nedbrytning av gastrointestinal mucin med hjälp av enzymer har involverats som en virulensdeterminant för ett antal enteropatogener (t.ex. Vibrio cholerae, Shigella-arter, Helicobacter pylori och Yersinia enterocolitica) . För C. albicans, som koloniserar slemhinneytor, kan mucinnedbrytning genom SAP2 göra det möjligt att närma sig epitelceller och/eller modifiera cellytor . Högre nivåer av sekretoriskt Candida-syreproteinas hittades hos barn med akut och kronisk diarré än hos friska kontrollpersoner

För att belysa den patogenetiska betydelsen av Candida-arter hos vuxna patienter med AAD utförde vi kvantitativa avföringskulturer för Candida-arter hos 395 immunokompetenta vuxna. Dessutom undersöktes produktionen av Saps

Metoder

Patienturval och insamling av avföringsproverAlla patienter på en medicinsk avdelning med 250 bäddar undersöktes dagligen under 11 månader för diarré eller för antibiotikabehandling i frånvaro av diarré. Diarré definierades som >3 grumliga eller vattniga avföringar per dag . Antibiotikabehandling definierades som att få orala eller intravenösa antibiotika i terapeutiska doser i ⩾1 dag. AAD definierades som >3 grumliga eller vattniga avföringar per dag under eller upp till 2 månader efter antibiotikabehandlingen . Patienterna rekryterades i följd till fyra undersökningsgrupper tills det förutbestämda antal som krävs för statistisk jämförelse uppnåddes (se statistisk analys nedan). Patienterna inkluderades endast en gång under sin sjukhusvistelse

Avföringsprover från alla patienter med diarré odlades för bakteriella patogener (salmonella, shigella, yersinia och campylobacter) på selektiv agar, undersöktes för ägg och parasiter och testades för Clostridium difficile genom odling på selektiv agar och med hjälp av det snabba C. difficile-testet (BD). Patienter med någon av dessa patogener uteslöts från studien. Således ingick 395 patienter (195 med diarré och 200 utan) i studien och tilldelades 4 grupper: (1) grupp A+D+, 98 AAD-patienter som fick antibiotika och upplevde diarré, (2) grupp A+D-, 93 patienter som fick antibiotika men inte upplevde diarré, (3) grupp A-D+, 97 patienter som inte fick antibiotika men upplevde diarré och (4) grupp A-D-, 107 kontrollpersoner som inte fick antibiotika och inte upplevde diarré

De 4 grupperna skiljde sig inte åt när det gäller köns- och åldersfördelning. Avföringsprover från alla försökspersoner samlades in omedelbart efter en avföring och fördes till laboratoriet i samma byggnad inom 15 minuter. Prover från avföring som passerat under natten förvarades vid 4°C och bearbetades nästa morgon

Candida kulturer och slide smearsAvföringsproverna späddes 1:10 med koksaltlösning, rördes om i en avföringshomogenisator och späddes återigen 1:1000 och 1:10000 med koksaltlösning. Hundra mikroliter av varje spädning överfördes till en Candida CHROMagar (BBL) och pläterades jämnt med en steril svabb. Efter inkubation vid 37 °C i 48 timmar i omgivande luft räknades Candida-kolonierna och klassificerades som C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis eller andra Candida-arter enligt koloniernas färg. Ett koloniantal ⩾105 cfu/mL avföring klassificerades som ”Candidaöverväxt” enligt Danna et al. . Ett glidutstryk av varje utspädning av de första 100 på varandra följande avföringsproverna färgades med Gram-färg och undersöktes med ljusmikroskopi för förekomst av jäst och leukocyter

Detektering av SapsKonsekventa Candida-isolat från patientgrupperna A-D- och A+D+ testades för aspartylproteinasutsöndring i bovint serumalbumin (BSA)-agar (1,17 % jästkolbas , 0,01 % jästextrakt och 0,2 % BSA ), som beskrivits på annat håll . Mediet justerades till pH 5,0, steriliserades genom filtrering (porstorlek 0,2 μm) och tillsattes till en lagerlösning av autoklaverad (2 %) agar. Proteolysen, som visar enzymaktiviteten, mättes i millimeter och poängsattes på samma sätt som på andra ställen: – eller ± (ingen synlig eller mycket begränsad förtydligande av agar runt kolonin förekom), 1+ (märkbar proteolys observerades) och 2+ (förtydligande av agar översteg till stor del kolonins kant). C. albicans stam SC5314 och en SAP2-nollmutant (tillhandahållen av B. Hube, Hamburgs universitet, Tyskland) undersöktes som kontroller

Statistisk analysEtt antal patienter med olika antal Candida i olika grupper jämfördes med hjälp av χ2-testet, och jästantalet på utstryksglas korrelerades med Candidaantalet från kulturer med hjälp av Pearsons korrelation. Skillnader i Sap-produktion beräknades med hjälp av Students t- och Fishers exakta test. Urvalsstorleken för odlingstestet beräknades till 91 utvärderingsbara patienter, och för Sap-testet beräknades den till 20 utvärderingsbara patienter per grupp, med ett α på 0,05 och en effekt på 0,8 (SigmaStat, version 2.0; Jandel Scientific). Skillnader med P<.05 ansågs vara signifikanta

Resultat

Candidaodlingar och glidutstrykningarResultaten av Candidaodlingarna visas i figur 1. I grupp A+D+ var Candida-positivitet (hos 77/98 patienter) och Candida-överväxt (hos 62/98 patienter) inte signifikant annorlunda än i grupp A+D- (75/93 patienter respektive 52/93 patienter ). I grupp A-D+ var Candidaöverväxt betydligt mindre vanligt än i grupp A+D+ (P=.003), men Candidapositiviteten var inte signifikant annorlunda (P=.612). Candida-positivitet och överväxt var signifikant mindre vanligt i grupp A-D- än i alla andra grupper (Candida-positivitet: 66/107 patienter, P=.013, jämfört med grupp A+D+; P=.005, jämfört med grupp A+D-; och P=.002, jämfört med grupp A-D+; Candida-överväxt: 15/107 patienter, P<.001, jämfört med alla andra grupper; figur 1)

Resultat av proteolytisk aktivitet på BSA-agarAllt sammantaget testades 23 A+D+- och 20 A-D-Candida-isolat för proteolytisk aktivitet i BSA-agar. Den genomsnittliga±SD-aktiviteten var 1,26±1,06 mm för A+D+-gruppen och 1,42±0,64 mm för A-D-gruppen. Av de 23 A+D+-isolaten hade 16 ett proteolysvärde på 1+ (klargöringszon på 1-2 mm) och 1 hade ett värde på 2+ (klargöringszon på 3-5 mm), vilket i båda fallen tyder på förekomst av proteinasenzymaktivitet. Av de 20 A-D-isolaten hade 17 ett proteolysvärde på 1+ och 2 ett värde på 2+. Alla C. albicans-isolat uppvisade klargöringszoner på BSA-medium (⩾1 mm, ⩾1+ poäng). I grupp A-D- visade 1 isolat av C. tropicalis ingen proteolys. I grupp A+D+ uppvisade 5 isolat av C. glabrata och 1 isolat av C. tropicalis ingen proteolys. Klareringszonerna i grupperna A-D- och A+D+ skiljde sig inte nämnvärt åt när de mättes antingen i millimeter (P = 0,568, Student’s t-test) eller med poängsystemet 1+/2+ (P = 0,294 och P = 0,590 för isolat med poäng 1+ respektive 2+, Fisher’s exact test) . När C. glabrata-isolat (som är kända för att vara negativa på proteinagar) togs bort fanns det ingen signifikant skillnad i Sap-produktion mellan grupperna (P=.347)

Diskussion

Candida överväxt har postulerats kunna orsaka AAD . Vi undersökte förekomsten och mängden Candida-arter hos patienter som misstänks ha AAD, patienter utan diarré men som tar antibiotika, patienter med diarré men som inte tar antibiotika och patienter utan diarré och som inte tar antibiotika (kontrollpersoner). En betydligt högre andel av avföringsprover från patienter som fick antimikrobiell behandling och hade diarré (A+D+-gruppen) var positiva för Candida-arter och hade högre koloniantal än prover från kontrollpersoner (A-D–gruppen). I en studie av Danna et al. sågs Candidaöverväxt (⩾105 cfu/mL avföring) hos 7 (29 %) av 24 AAD-patienter. I den studien hade 0 av 24 patienter utan diarré men som fick antibiotika Candida överväxt . I vår studie hade dock 52 (56 %) av 93 patienter med antibiotika men utan diarré Candida överväxt, och ingen skillnad sågs jämfört med AAD-patienter. Eftersom vi undersökte ett nästan fyrfaldigt antal patienter (93 jämfört med 24) kan skillnaderna mellan våra resultat och dem från Danna et al. bero på den större urvalsstorleken i vår studie

För att bedöma diarréens påverkan på antalet Candida i tarmen undersökte vi även patienter som inte fick antibiotikabehandling men som hade diarré (grupp A-D+). I denna grupp var Candidaöverväxt (⩾105 cfu/mL avföring) betydligt mindre frekvent än hos AAD-patienterna, men Candida-positiviteten var inte signifikant annorlunda. Tidigare studier visade att den normala avföringsfloran var markant minskad hos AAD-patienter. I studier där effekterna av bredspektrumantibiotika på sammansättningen av tarmmikrofloran hos människor undersöktes observerades en signifikant omvänd korrelation mellan logaritmen för den maximala ökningen av jästsvampar och logaritmen för den maximala minskningen av anaeroba bakterier . Eftersom vi fann ökad Candida-positivitet hos AAD-patienter, A+D-patienter och A-D+-patienter, föreslår vi att minskningen av bakterier i avföringen, antingen på grund av antibiotikabehandling eller utspädning vid diarré, gjorde det möjligt för Candida-arter att expandera, vilket resulterade i ökat antal Candida-positivitetsräkningar

I vår studie korrelerade inte medelantalet jäst på utstryksmaterial som färgats med Gram-färg med Candida-kulturer när de beräknades vare sig med det totala antalet jästar på utstryksmaterialet (r=.27) eller med det index som föreslagits av Danna et al. (r=.12). Diskrepansen mellan det stora antalet jästliknande celler som räknas i ljusmikroskop och den svaga eller obefintliga tillväxten av Candida-arter har rapporterats på andra ställen 15]. I den studien antog författarna att en stor majoritet av de jästsvampar i avföringen som upptäcktes i mikroskopet inte var levande . Våra resultat tyder på att stor försiktighet bör iakttas vid tolkning av avföringsprov från patienter med AAD och som är positiva för Candida-arter. Nyttan av att analysera avföring för Candida-räkningar genom odling eller utstryksglas hos dessa patienter är allvarligt ifrågasatt. Frånvaron av leukocyter i prover som färgats med Grams färgning överensstämde med tidigare resultat . Våra resultat bekräftade också att Candida-arter var en del av den normala tarmfloran

Aktiv sekretion medierad av ett svampgift eller toxinliknande ämnen har diskuterats som mekanism för Candida-relaterad AAD . Eftersom Saps är de viktigaste virulensfaktorerna vid Candida-infektioner , undersökte vi dessa proteinaser in vitro. Hittills har 10 olika SAP-gener identifierats i C. albicans . Eftersom Sap har rapporterats bidra till vävnadsskador i en modell av oral candidos hos människa kan dessa proteinaser också skada tarmepitelceller. Men hos 8 patienter som misstänktes ha Candida-relaterad AAD fanns det inga tecken på kolit eller cellskador

I vår studie producerade alla undersökta C. albicans-stammar Sap, och det fanns ingen signifikant skillnad mellan mängden Sap som producerades i Candida-isolat från AAD-patienter och kontrollpersoner. Högre nivåer av sekretoriska Candida-syreproteinaser hittades hos barn med akut och kronisk diarré än hos friska kontrollpersoner . Även om Sap-nivåerna beräknade för hela gruppen barn med akut eller kronisk diarré var signifikant högre än nivåerna hos kontrollpersoner, var detta inte fallet i enskilda fall. Av 9 Candida-isolat hade 4 från kontrollpersoner (barn utan diarré) Sap-nivåer som var jämförbara med dem hos barn med kronisk diarré, och 2 av 9 kontrollpersoner hade nivåer som var jämförbara med dem hos barn med akut diarré. Trots dessa höga Sap-nivåer hade kontrollpersonerna inte diarré. Detta står i kontrast till resultaten i tidigare studier, där Sap-produktionen hos symtomatiska patienter alltid nådde högre nivåer än hos kontrollpersoner: Sap-produktionen hos Candida-arter från vaginitpatienter översteg alltid Sap-produktionen hos Candida från bärare, och Candida-stammar från oral candidiasis hos aidspatienter producerade ∼8 gånger mer Sap än isolat från kontrollpersoner

Sap-produktionen indikeras på ett enhetligt sätt av BSA-agar-testet och ELISA . Dessutom korrelerade höga nivåer av Sap som utsöndrades in vitro och upptäcktes med BSA-agar eller ELISA med ökade nivåer av Sap in vivo (t.ex. i vaginala vätskor från hiv-positiva vaginitpatienter) . Man kan spekulera i att Candida species tillfälligt producerar höga nivåer av Sap in vivo men förlorar denna förmåga på grund av t.ex. subkulturering. I C. albicans som isolerats från munhålor visades att förhöjd Sap-produktion var en stabil egenskap. Å andra sidan uppvisade C. albicans-isolat med låg proteinasproduktion en stabil Sap-produktion på låg nivå vid upprepade subkulturer

Sammanfattningsvis bekräftar resultaten av vår studie inte de tidigare föreslagna patogenetiska mekanismerna för Candida-relaterad AAD . Våra uppgifter tyder på att förhöjda Candidaantal är ett resultat av antibiotikabehandling eller diarré i sig snarare än en orsak till AAD. Produktionen av den viktigaste svampens virulensfaktorn Sap hos patienter med AAD skiljde sig inte från produktionen hos kontrollpersoner, vilket tyder på att detta svampgift kanske inte är orsaken till AAD hos vuxna. Andra virulensfaktorer hos svampar (t.ex. phospholipases) warrant further investigation