Cellbiologi@Yale

Föreläsningens innehåll

Membranbundna organeller

Eukaryota celler innehåller samlingar av proteiner som fungerar som en enhet som kallas organeller. Vissa av dessa organeller är omgivna av ett membran som till sin struktur liknar cellmembranet men som har en annan sammansättning av protein och fosfolipid.

Membranbundna organeller erbjuder flera fördelar för eukaryota celler. För det första kan cellerna koncentrera och isolera enzymer och reaktanter i en mindre volym, vilket ökar hastigheten och effektiviteten av kemiska reaktioner. För det andra kan cellerna begränsa potentiellt skadliga proteiner och molekyler i membranbundna organeller och på så sätt skydda resten av cellerna från deras skadliga effekter. Lysosomen, som är en membranbunden organell, innehåller till exempel många enzymer som smälter proteiner, nukleinsyror och lipider. Om dessa enzymer släpptes ut i cytosolen skulle de kunna tugga sönder cellens proteiner, nukleinsyror och lipider, vilket skulle leda till celldöd. Membranet som omger lysosomen håller dessa matsmältningsenzymer borta från resten av cellen.

Mikrotubulernas organisering av cytoplasman

Organeller och proteiner är vanligtvis inte slumpmässigt fördelade i hela cellen utan organiseras genom att de lokaliseras till områden där de behövs. Cellen använder mikrotubuli och motorproteiner för att hjälpa till att lokalisera organeller. Mikrotubuli är långa filament som sträcker sig över hela cytoplasman. Två typer av motorproteiner, kinesiner och dyneiner, går längs mikrotubuli och genererar kraft för att dra organeller genom cytoplasman.

Mikrotubuli är polymerer av en heterodimer av alfa- och betatubullin. Tubulin polymeriseras till linjära protofilament och en mikrotubuli innehåller 13 protofilament arrangerade i en cylinder med en ihålig kärna. Mikrotubuli är polariserade i en minusända och en plusända. Mikrotubuli växer från sina plusändar genom att lägga till fler tubulinunderenheter. Mikrotubuliens minusändar är instabila och stabiliseras av proteiner i mikrotubuliorganisationscentret (MTOC). Om MTOC befinner sig i centrum av en cell strålar mikrotubuli utåt med sina plusändar mot plasmamembranet

Kinesiner och dyneiner vandrar längs mikrotubuli genom att utnyttja energin från ATP-hydrolys. Båda uppsättningarna av proteiner innehåller motordomäner som binder mikrotubuli och hydrolyserar ATP. Motordomänerna genererar rörelse längs mikrotubuli. De flesta kinesiner går mot plusändan av mikrotubuli, medan dynein går mot minusändan. Detta ger cellerna två verktyg för att styra fördelningen av organeller längs mikrotubuli. Kinesiner och dyneiner innehåller också en lastbindningsdomän som förbinder dem med olika organeller. Kinesiner är en stor familj av proteiner och den lastbindande domänen är den mest divergerande, vilket gör att olika medlemmar av kinesinfamiljen kan binda olika organeller. Dynein är ett stort komplex av flera proteiner och hur det binder last är mindre klart.

Aktinfilament stöder också transporten av cellmaterial, men över mycket kortare sträckor än mikrotubuli. Aktinfilament är en polymer av aktin som är ett litet globulärt protein. Aktinfilamenten är en spiralformad uppsättning av aktin och har i likhet med mikrotubuli en plus- och en minusända där filamenten växer lättare från sina plusändar. Aktinfilamenten saknar de omfattande sidokontakterna hos mikrotubuli och är vanligtvis mycket kortare än mikrotubuli. Aktinfilament tenderar att lokaliseras nära cellmembranet där de ger strukturellt stöd.

Myosiner är en klass av motorproteiner som kan generera kraft längs aktinfilament. Vissa myosiner är involverade i cellkontraktion (dvs. sammandragning av muskler), medan andra stöder organellers rörelse och positionering. Myosiner av klass V är involverade i transporten av organeller i flera olika typer av celler. I likhet med kinesins struktur innehåller myosiner av klass V en motordomän som binder aktinfilament och använder energin från ATP-hydrolys för att gå längs filamenten. C-terminus av myosin V binder organeller.

För att transportera och positionera organeller använder cellerna ofta både mikrotubuli och aktinfilament. Mikrotubuli, kinesiner och dyneiner används för att förflytta organeller över långa avstånd (flera mikrometer eller mer), medan aktinfilament transporterar organeller över korta avstånd (t.ex. nära plasmamembranet). Ofta innehåller en organell mer än en typ av motorprotein (t.ex. kinesin och myosin V) så att cellerna kan använda båda uppsättningarna filament för att positionera organellen.

Signalsekvenser

För att bibehålla identiteten och funktionen hos de olika organellerna och plasmamembranen måste cellerna rikta in specifika proteiner till organeller och andra intracellulära avdelningar. De flesta av dessa proteiner innehåller en kort sekvens, en så kallad signalsekvens, som bestämmer deras intracellulära placering. Signalsekvenser kan lokaliseras var som helst i ett protein men finns ofta i N-terminus. Signalsekvenser som riktar proteiner till samma organell har ofta inte samma primära sekvens. Det är vanligtvis sekvensens övergripande biokemiska egenskaper som avgör om den riktar ett protein till en organell. Signalsekvenser används för att importera både lösliga proteiner och integrala membranproteiner.

Import av proteiner till membranbundna organeller

Eftersom membranen som omger organellerna begränsar passagen av proteiner har organellerna utvecklat olika mekanismer för att importera proteiner från cytoplasman. De flesta organeller innehåller en uppsättning membranproteiner som bildar en portal. Denna por tillåter passage av proteiner med rätt signalsekvens. Vissa porer (ER, mitokondrier) kan endast ta emot oveckade proteiner, medan andra porer (kärnan, peroxisomen) låter veckade proteiner passera.

Targeting Proteins to the Endoplasmic Reticulum

Proteiner som är avsedda för sekretion, plasmamembranen eller någon annan organell i sekretorsvägen förs först in i ER. De flesta proteiner korsar ER co-translationellt och syntetiseras av ribosomer i ER. Både lösliga proteiner (proteiner som befinner sig i organellernas lumen eller utsöndras) och integrala membranproteiner riktas mot ER och translokaliseras genom samma mekanism.

Signalsekvensen för ER-proteiner befinner sig vanligtvis vid N-terminus. Signaligenkänningspartikeln (SRP), ett komplex bestående av sex proteiner och ett RNA, binder signalsekvensen omedelbart efter det att den har översatts. SRP:n interagerar också med ribosomen och stoppar översättningen. Ytan på ER-membranen innehåller en receptor för SRP. SRP-receptorn rekryterar SRP, nascent ER-protein och ribosomen till ER. SRP-receptorn frigör SRP från signalsekvensen och låter översättningen fortsätta på ER-membranet.

Ribosomer på ER-membranet binder till proteintranslokatorn. Translokatorn är ett transmembranprotein som bildar en vattenpora. Poran är den kanal genom vilken de nysyntetiserade ER-proteinerna kommer att translokeras över ER-membranet. Translation av ER-proteinet genererar den ”kraft” som driver ER-proteinet genom kanalen.

Lösliga proteiner translokeras helt genom kanalen; signalsekvensen stannar kvar i kanalen och klyvs från resten av proteinet av ett proteas i ER:s lumen.

Integralmembranproteiner innehåller en stopptransfersekvens nedströms från signalsekvensen. Stoppöverföringssekvensen upphör translokationen genom kanalen och den del av proteinet som ligger efter stoppöverföringssekvensen befinner sig utanför ER. Integrala membranproteiner kan translokeras så att antingen deras N-terminus eller C-terminus befinner sig i ER:s lumen. Proteiner med C-terminus i lumen tenderar att ha en intern signalsekvens. Translokatorn tycks öppna på ena sidan för att låta integrala membranproteiner diffundera in i det omgivande lipiddubbelskiktet.

Vissa proteiner spänner över membranet flera gånger och dessa proteiner innehåller efter stoppöverföringssekvensen en startöverföringssekvens som återigen startar translokationen av proteinet genom kanalen. Ett protein med en signalsekvens, stoppöverföring och startöverföring skulle spänna över membranet två gånger med en slinga som finns i cytosolen eller lumen. För att generera proteiner som spänner över membranet flera gånger skulle proteinet behöva flera alternerande stopp- och startöverföringssekvenser.

När proteinerna väl kommer in i ER veckar de sig till sina tredimensionella strukturer. Det finns flera mekanismer som hjälper till att vika proteiner, bland annat chaperoner och glykosylering. ER innehåller också mekanismer för att hantera proteiner som inte lyckas veckas.

Targeting Proteins to Mitochondria

Tyvärr innehåller mitokondrier sitt eget genom, men de flesta mitokondriella proteiner kodas av nukleära gener, vilket kräver en mekanism för att rikta och importera dessa proteiner till mitokondrier. I likhet med proteiner som importeras till ER innehåller mitokondriella proteiner en signalsekvens som riktar dem till mitokondrier. Till skillnad från ER-proteiner importeras mitokondriella proteiner posttranslationellt. Eftersom proteiner måste vara utvikta för att translokeras genom kanaler i mitokondriernas membran, hålls mitokondriella proteiner utvikta i cytosolen av chaperoner.

Proteinimport till mitokondrier liknar import till ER, men kompliceras av att det finns två membran runt mitokondrier. Mitokondriella proteiner kan finnas i det yttre membranet, det inre membranet, intermembranutrymmet eller matrisen (utrymmet inuti det inre membranet). mitokondrierna har således translokatorer som möjliggör passage av proteiner över det yttre membranet och över det inre membranet. TOM-komplexet förmedlar passage över det yttre membranet medan TIM-komplexet förmedlar passage över det inre membranet.

Translokalisering av proteiner till mitokondrier

Signalsekvensen som riktar proteiner till matrisen finns vanligtvis vid N-terminus. Signalsekvensen känns igen av proteiner i TOM-komplexet. TOM-komplexet för proteinerna vidare till det inre membranutrymmet där TIM-komplexet i det inre membranet för proteinet vidare till matrisen. TOM- och TIM-komplexen arbetar ofta tillsammans för att translokera ett protein över båda membranen. Translokationen över mitokondriernas membran är energiberoende. Chaperoner i matrisen hjälper till att ”dra” proteinet över det inre membranet och kräver ATP-hydrolys för att fungera. Proteinerna viks inuti matrisen.

Proteiner som är riktade mot det inre membranet använder en liknande mekanism som matrisproteiner, men innehåller en stoppöverföringssekvens som känns igen av TIM-komplexet. Proteiner som är riktade mot det yttre membranet translokeras över det yttre membranet till intermembranutrymmet och importeras sedan till det yttre membranet av SAM-translokatorn. Proteiner som är riktade mot intermembranrummet infogas delvis i det inre membranet och klyvs sedan av ett proteas och släpps ut i det inre membranrummet.

Import och export av nukleära proteiner

I motsats till ER och mitokondrier importerar kärnan främst lösliga proteiner. Dessutom pendlar proteiner ofta mellan kärnan och cytoplasman och cellen använder kärnans import/export för att reglera flera kritiska biokemiska vägar. Kärnan är omgiven av två membran och inbäddad i dessa membran finns tusentals kärnporer genom vilka proteiner och andra makromolekyler (RNA, ribsosomer) kommer in i och ut ur kärnan. Kärnporerna stabiliseras i membranen av laminer, ett cytoskelettnätverk som ligger under det inre kärnmembranet och ger strukturellt stöd åt membranet. Kärnporen begränsar passage av material baserat på storlek: saker som är mindre än ~ 30 kD diffunderar fritt genom porerna, men stora molekyler behöver ett sätt att komma in och ut. Proteiner som trafikerar in i kärnan innehåller en nukleär importsignal och de som också måste lämna kärnan innehåller en nukleär exportsekvens.

Skillnad mellan cytoplasma och nukleoplasma

För att generera riktad transport av proteiner in i och ut ur kärnan måste proteiner veta om de befinner sig i cytoplasma eller inne i kärnan. För att skilja mellan kärnan och cytoplasman använder cellerna ett litet GTP-bindande protein som kallas Ran. Liksom alla GTP-bindande proteiner existerar Ran antingen i ett GTP-bundet tillstånd eller GDP-bundet tillstånd. Två proteiner katalyserar växlingen mellan dessa tillstånd. Ran-GAP (GTPase activating protein) katalyserar GTP-hydrolys som genererar Ran-GDP. Ran-GEF (guanine nucleotide exchange factor) katalyserar frisättning av GDP och återbindning av GTP, vilket genererar Ran-GTP. Ran-GAP lokaliseras till den cytoplasmatiska sidan av kärnporerna medan Ran-GEF associeras med kromatin och därför lokaliseras till kärnan. Som ett resultat av detta är det mesta av Ran i kärnan bundet till GTP och det mesta av Ran i cytoplasman bundet till GDP.

Nukleär import

Receptorer (importiner) binder nukleära importsekvenser i proteiner. Importiner interagerar också med filamenter som sträcker sig från den cytoplasmatiska sidan av kärnporerna. Genom en okänd mekanism kan importiner som är bundna till sin last trafikera genom kärnporten. Inne i porerna möter importin-lastkomplexet Ran-GTP. Ran-GTP dissocierar importinerna från lasten och frigör lastproteiner för att utföra sitt arbete i kärnan.

Nukleärexport

Många proteiner som kommer in i kärnan måste exporteras till cytoplasman (t.ex. importiner). Dessa proteiner innehåller en kärnexportsekvens som interagerar med en receptor som kallas exportin. Ran-GTP binder till detta exportin-lastkomplex och stabiliserar interaktionen. Exportin-last-RanGTP-komplexet färdas genom porerna (oklar mekanism) där det möter Ran-GAP på cytoplasmasidan. Ran-GAP omvandlar Ran-GTP till Ran-GDP vilket gör att exportin dissocieras från sin last.

Import av proteiner i peroxisomer och Zellewegers syndrom

Peroxisomer är små organeller (~ 1 µm i diameter) som utför en mängd olika funktioner för cellerna. Peroxisomer metaboliserar skadliga kemikalier (fenoler, formaldehyd, etanol), metaboliserar fettsyror och katalyserar ett steg i syntesen av plasmalogen som är en lipid som finns i myelin.

Proteiner som är riktade till peroxisomer innehåller en signalsekvens som känns igen av en familj av proteiner som kallas Pexproteiner. Vissa av dessa Pex-proteiner binder till signalsekvenser medan andra för en por i peroxisomernas membran som tillåter inträde av peroxisomproteiner.

Celler som innehåller mutationer i Pex-proteiner kan inte importera proteiner till peroxisomer och följaktligen saknar dessa celler peroxisomer. Mutationer i Pex-proteiner är förknippade med en uppsättning sjukdomar som kallas Zellewegers syndrom. Vid Zellewegers syndrom saknar spädbarn muskeltonus och ofta förmågan att suga. Spädbarn uppvisar också kraniofaciala avvikelser och en förstorad lever. Prognosen för spädbarn som lider av Zellewegers syndrom är dålig och de flesta överlever inte längre än ett år.

På grund av att peroxisomer bidrar till syntesen av en lipid som finns i myelin uppvisar patienter med Zellewegers sjukdom ofta dålig myelinisering av neuroner. Myelinisering är avgörande för neuronernas funktion när det gäller att leda signaler till målceller.