PMC

Denna föreläsning bygger på en nyligen genomförd granskning.

Den ökande bördan av diabetes i världen är välkänd, och effekterna på hälso- och sjukvårdskostnader och mänskligt lidande, sjuklighet och dödlighet kommer främst att märkas i utvecklingsländerna, däribland Indien, Kina och länder i Afrika. Nya läkemedel utvecklas i snabb takt, och under de senaste åren har flera nya klasser av substanser utvecklats för behandling av diabetes, t.ex. glukagonliknande peptidmimetika (GLP-1), dipeptidylpeptidas-4-hämmare (DPP-4) och natriumglukostransportör-2-hämmare (SGLT2). Nya kirurgiska behandlingar har också blivit alltmer tillgängliga och förespråkas som effektiva behandlingar av diabetes. Gastrisk restriktionskirurgi, gastrisk bypass-kirurgi, samtidig transplantation av bukspottkörteln och njurarna samt transplantation av bukspottkörteln och öarna har alla introducerats under de senaste åren. För att undvika traumat av en stor operation har det gjorts många studier om transplantation av isolerade öar som tagits från en kadaverpankreas. Uppmuntran kom från ”Edmonton-protokollet” som Shapiro och medarbetare beskrev i New England Journal år 2000. Inslarna injicerades i portalvenen och patienterna, särskilt de som led av farlig, hypoglykemisk omedvetenhet, behandlades innan de hade utvecklat allvarliga diabeteskomplikationer, särskilt njurkomplikationer. Även om de tidiga resultaten var lovande, med cirka 70 procent av patienterna som inte behövde några insulininjektioner efter två år, hade de flesta av dessa patienter försämrats efter fem år och behövde insulintillskott, trots att vissa hade fått mer än en transplantation av öar. I de senaste patientserierna har Edmonton-gruppen rapporterat om bättre långtidsresultat med användning av den monoklonala anti-lymfocytantikroppen Campath 1H som gavs som induktionsmedel. 45 % av patienterna var insulinoberoende efter fem år och 75 % hade påvisbar C-peptid.

Men kadavarisk bukspottkörtel och öar konkurrerar om samma källa och är begränsade i antal, och ingen av dessa behandlingsformer skulle därför kunna erbjudas till det stora flertalet diabetespatienter. Vissa har försökt använda en alternativ källa, t.ex. inkapslade öar från neonatala eller vuxna grisar. Detta är fortfarande mycket experimentellt och kommer att vara ett långt borta alternativ med många tekniska och eventuellt etiska hinder som måste övervinnas.

När man på senare tid har man i och med framgångarna med utvecklingen av pluripotenta vuxna stamceller (från Yamanaka, som tilldelades Nobelpriset i medicin 2012 för att ha utvecklat inducerade pluripotenta stamceller – iPSC) försökt hitta nya metoder som är mer lättillgängliga och tillgängliga. Mycket hopp hämtades inledningsvis från forskningen om embryonala stamceller (ESC), eftersom dessa celler kan övertalas att föröka sig och utvecklas till vilken vävnad som helst, men processen var dyr, och problemet med teratombildning från dessa stamceller visade sig vara extremt svårt att övervinna. Många av de viktiga faktorer som har att göra med fosterutvecklingen är inte kända och kan inte reproduceras. Vissa framsteg har dock gjorts, och (ibland) har celler övertalats att utsöndra insulin, men än så länge har det funnits mycket minimala terapeutiska tillämpningar.

Vetenskapsmännen är nu medvetna om att det att övertala en cell att producera insulin bara är ett steg på vad som kan bli en lång och svår resa. Cellulära öar är högt specialiserade för att inte bara ha en basal frisättning av insulin utan också för att snabbt reagera på förändringar i glukoskoncentrationen i blodet. När det gäller insulin är processen och regleringen av att stänga av sekretionen lika viktig som att sätta igång sekretionen.

En mängd olika tillvägagångssätt har gjorts med olika utgångspunkter. Stamcellen reproducerar sig själv och kan då också dela sig asymmetriskt och bilda en annan celltyp: Detta kallas differentiering. Även om man till en början trodde att de endast kunde fås från embryon, kan icke-embryonala stamceller nu utan alltför stora svårigheter erhållas från neonatal vävnad, navelsträng och även från en mängd olika vuxna vävnader, inklusive benmärg, hud och fett. Dessa stamceller kan expanderas och differentieras, men deras repertoar är begränsad jämfört med embryonala stamceller: oligo- eller pluri- till skillnad från toti-potenta embryonala stamceller. Ännu mer nyligen har det funnits ett stort intresse för processen med direkt celltransdifferentiering, där en engagerad och fullt differentierad cell, t.ex. en levercell, förändras direkt till en annan celltyp, t.ex. en betacell i öglan, utan att inducera en de-differentiering tillbaka till stamcellsstadiet.

Yamanaka lyckades 2006 framställa pluripotenta stamceller från musens neonatala och vuxna fibroblastkulturer genom att tillsätta en cocktail av fyra definierade faktorer. Detta ledde till en rad andra studier som utvecklade processen, som visade sig kunna upprepas med mänsklig vävnad såväl som med laboratoriemöss. Genom att använda iPS-celler undvek man de etiska begränsningarna med att använda mänskliga embryon, men det har ändå funnits andra problem och hinder. Det finns nya rapporter om iPS-celler som blir antigena mot en autolog eller isolog värd, och cellerna kan ackumulera DNA-avvikelser och till och med behålla ett epigenetiskt minne av den ursprungliga celltypen och därmed ha en tendens att återgå till sin ursprungliga celltyp. Liksom embryonala stamceller kan iPS-celler bilda teratom, särskilt om differentieringen inte är fullständig.

Trots detta har man inte lyckats särskilt bra med att styra differentieringen av iPSC till att bilda betaceller från öar i tillräcklig mängd som kommer att utsöndra och upphöra med utsöndringen som svar på förändringar i blodsockernivåerna.

Ett annat tillvägagångssätt som har prövats är att kombinera genterapi med stamceller. Vissa framsteg har gjorts när det gäller att försöka uttrycka den önskade insulingenen i mer primitiva odifferentierade celler genom att locka stamceller med differentieringsfaktorer in vitro och sedan genom direkt gentransfektion med hjälp av plasmider eller en viral vektor. Vi och andra har använt en mänsklig insulingenkonstruktion och infört ex vivo eller in vivo i celler genom direkt elektroporation (i ex vivo-celler förstås) eller genom virala vektorer. Adenovirus, adeno-associerat virus och olika retrovirus har studerats mest, särskilt lentivirus. Alla typer av genteknik ger dock upphov till farhågor, inte bara för infektion från viruset utan också för att onko-gener avslöjas, vilket kan leda till malignitet, och det finns strikta bestämmelser om hur man skall gå till väga för att undvika dessa risker.

Vi har intresserat oss för stamceller från navelsträng och mesenkymala stamceller som måltavlor för kombinerad stamcells- och genterapi. Dessa celler kan erhållas på ett relativt enkelt och reproducerbart sätt från annars kasserad navelsträng eller från lättillgänglig benmärg, genom att cellerna selekteras ut med hjälp av olika standardtekniker. Fett, amnion och navelsträngsblod är också källor från vilka mesnechymala stamceller kan utvinnas. Efter en proliferativ fas får cellerna ett utseende som liknar en matta av fibroblaster, som kan differentieras till ben-, brosk- eller fettceller. Även om mesenkymala stamceller från de olika nämnda källorna kan se likadana ut är deras differentieringspotential idiosynkratisk och skiljer sig åt, vilket gör det olämpligt och svårt att betrakta dem som en enhetlig källa till målceller. Neonatala amnionceller och celler från navelsträngen har låg immunogenicitet och uttrycker inte HLA-klass II-antigen. De utsöndrar också faktorer som hämmar immunreaktioner, till exempel lösligt HLA-G. Även om immunogeniciteten har minskat avsevärt är de fortfarande inte autologa och det finns därför fortfarande en risk för avstötning av allotransplantat. De har den fördelen att de skulle kunna förökas, frysas och bankas i stora mängder och skulle kunna användas hos patienter som redan behöver immunosuppressiva medel, till exempel de som har njurtransplantationer.

I Singapore har våra studier av amnionceller som härrör från navelsträngen visat en viss framgång när det gäller att få uttryck för insulin- och glukagongener, men liten eller ingen sekretion av insulin in vitro. Tillsammans med transfektion av insulingener in vitro kunde man efter peritoneal transplantation till sterptozotocininducerade diabetiska möss se en viss förbättring av glukosnivåerna. Våra kolleger i Singapore har använt en annan modell med autologa hepatocyter från streptozotocininducerade diabetiska grisar. Dessa separerade hepatocyter transfekterades framgångsrikt ex vivo med en genkonstruktion av humant insulin genom elektroforering, och sedan injicerades cellerna direkt tillbaka i leverparenkymet med hjälp av flera separata injektioner. Grisarna botades från sin diabetes i upp till nio månader – vilket är en anmärkningsvärd bedrift. Eftersom det rörde sig om autotransplantationer behövdes inga immunosuppressiva läkemedel, utan levercellerna erhölls från stora öppna kirurgiska biopsier. Detta behov av kirurgiskt avlägsnande av levervävnad skulle begränsa dess tillämpbarhet, men det har ändå varit en bra studie för att bevisa konceptet. I samband med autoimmun diabetes kan risken för återkommande sjukdom mycket väl kvarstå om man inte kan definiera och eliminera målet för den autoimmuna attacken. I dessa svinförsök användes den humana insulingenen med en glukossensorisk promotor EGR-1. Inget virus var inblandat och plasmiden integreras inte. Delning av den transfekterade cellen skulle späda ut genaktiviteten, men ett stort antal plasmider kan produceras billigt. Samma arbetsgrupp transfekterade framgångsrikt mesenkymala stamceller från benmärg med plasmidet för den humana insulingenen med hjälp av samma EGR-1-promotor och elektroforering. Detta botade diabetiska möss efter direkt intrahepatisk och intraperitoneal injektion.

Slutningsvis bör man vara försiktig med att tolka resultaten av dessa och andra rapporter om cell- och genterapi för diabetes. In gene transfection and/or transplantation of insulin-producing cells or clusters in the diabetic rodent, there have been many reports in the literature, but only a few of these claims have been reproduced in independent laboratories. We have suggested the need to satisfy ”The Seven Pillars of Credibility” as essential criteria in the evaluation of claims of success in the use of stem cell and/or gene therapy for diabetes.

1. Cure of hyperglycemia

2. Response to glucose tolerance test

3. Evidence of appropriate C-peptide secretion

4. Weight gain

5. Prompt return of diabetes when the transfecting gene and/or insulin producing cells are removed

6. No islet regeneration of stereptozotocin-treated animals and no re-generation of pancreas in pancreatectomized animals

7. Presence of insulin storage granules in the treated cells