Úloha kandid u průjmu spojeného s antibiotiky

Abstrakt

Pro kvantitativní posouzení úlohy druhů Candida u průjmu spojeného s antibiotiky (AAD) byly vzorky stolice od celkem 395 pacientů a kontrolních osob kultivovány v diferenciálním izolačním médiu: 98 pacientů mělo AAD, 93 pacientů užívalo antibiotika, ale nemělo průjem (A+D-), 97 pacientů neužívalo antibiotika, ale mělo průjem (A-D+), a 107 pacientů byly kontrolní subjekty (A-D-). Dále byla testována produkce sekretované aspartylové proteinázy (Sap). U pacientů s AAD se pozitivita Candida (77/98) a přerůstání Candida (62/98) nelišily od pacientů s A+D- (75/93 a 52/93 , v tomto pořadí). Přerůstání kandid u pacientů A+-D (40/97, P=,003) bylo méně časté než u pacientů AAD, ale pozitivita kandid se nelišila (80/97, P=,612). U kontrolních osob byla pozitivita Candida a přerůstání méně časté než u všech ostatních skupin. Produkce Sap se mezi pacienty s AAD a kontrolními osobami nelišila (P=,568 a P=,590). Údaje naznačují, že zvýšené počty Candida jsou spíše důsledkem léčby antibiotiky nebo průjmu než příčinou AAD

Orální drozd a ezofagitida jsou nejčastějšími patologickými projevy infekcí vyvolaných Candida . O úloze bakterií rodu Candida při průjmech spojených s podáváním antibiotik (AAD) se vedou diskuse . Za příčinu průjmu u pacientů po léčbě antibiotiky se považují fekální koncentrace druhů Candida ⩾105 KTJ/ml stolice . Bylo zjištěno, že pacienti, kteří dostávali antibiotika, aniž by se u nich vyvinul průjem, měli <105 KTJ hub rodu Candida/ml stolice

Sekreční aspartylové proteinázy (Saps) jsou důležité faktory virulence produkované druhy Candida. Saps se podílejí na adherenci Candida albicans k lidské sliznici a na invazi do lidských tkání. Souvislost mezi expresí Saps a virulencí Candida byla prokázána u orální kandidózy a Candida vaginitidy u pacientů infikovaných virem lidské imunodeficience (HIV) . U AAD související s kandidami se jako patogenetický mechanismus průjmu diskutuje aktivní sekrece zprostředkovaná houbovým toxinem nebo látkami podobnými toxinu . U C. albicans bylo identifikováno 10 různých genů SAP . U Candida tropicalis byla pozorována slabá extracelulární proteolytická aktivita, zatímco Candida glabrata nevykazuje žádnou proteolytickou aktivitu na proteinovém agaru

C. albicans je známa produkcí aspartylových proteináz při pěstování v médiu s proteinem jako jediným zdrojem dusíku , přičemž exprese genu SAP2 je zásadně zodpovědná za proteolytickou aktivitu pozorovanou u většiny kmenů rostoucích v kvasinkové formě in vitro . Saps také vykazují proteolytickou aktivitu v gastrointestinálním traktu; byla prokázána exprese SAP při orální kandidóze a rozklad gastrointestinálního mucinu pomocí Saps . Degradace gastrointestinálního mucinu enzymy byla označena za determinant virulence řady enteropatogenů (např. Vibrio cholerae, Shigella species, Helicobacter pylori a Yersinia enterocolitica) . U C. albicans, který kolonizuje slizniční povrchy, může rozklad mucinu pomocí SAP2 umožnit přiblížení k epiteliálním buňkám a/nebo modifikaci buněčných povrchů . U dětí s akutním a chronickým průjmem byly zjištěny vyšší hladiny sekreční kyselé proteinázy Candida než u zdravých kontrolních osob

Pro objasnění patogenetického významu druhů Candida u dospělých pacientů s AAD jsme provedli kvantitativní kultivaci stolice na druhy Candida u 395 imunokompetentních dospělých osob. Dále byla zkoumána produkce Saps

Metody

Výběr pacientů a odběr vzorků stoliceVšichni pacienti na lékařském oddělení s 250 lůžky byli denně po dobu 11 měsíců vyšetřováni na průjem nebo na antibiotickou léčbu při absenci průjmu. Průjem byl definován jako >3 kašovité nebo vodnaté stolice za den . Antibiotická léčba byla definována jako podávání perorálních nebo intravenózních antibiotik v terapeutických dávkách po dobu ⩾1 dne. AAD byla definována jako >3 kašovité nebo vodnaté stolice denně během léčby antibiotiky nebo do 2 měsíců po ní . Pacienti byli postupně zařazováni do 4 studijních skupin, dokud nebylo dosaženo předem stanoveného počtu potřebného pro statistické srovnání (viz statistická analýza níže). Pacienti byli zařazeni pouze jednou během hospitalizace

Vzorky stolice od všech pacientů s průjmem byly kultivovány na bakteriální patogeny (salmonely, shigely, yersinie a kampylobaktery) na selektivním agaru, byly vyšetřeny na přítomnost vajíček a parazitů a byly testovány na Clostridium difficile kultivací na selektivním agaru a pomocí rychlého testu na C. difficile (BD). Pacienti s některým z těchto patogenů byli ze studie vyloučeni. Do studie tak bylo zařazeno 395 pacientů (195 s průjmem a 200 bez průjmu), kteří byli rozděleni do 4 skupin: (1) skupina A+D+, 98 pacientů s AAD, kteří dostávali antibiotika a měli průjem; (2) skupina A+D-, 93 pacientů, kteří dostávali antibiotika, ale neměli průjem; (3) skupina A-D+, 97 pacientů, kteří nedostávali antibiotika, ale měli průjem; a (4) skupina A-D-, 107 kontrolních subjektů, kteří nedostávali antibiotika a neměli průjem

Tyto 4 skupiny se nelišily pohlavím a věkovým rozložením. Vzorky stolice všech subjektů byly odebrány bezprostředně po stolici a do 15 min. byly přineseny do laboratoře ve stejné budově. Vzorky stolice odevzdané během noci byly uchovávány při 4 °C a zpracovány následující den ráno

Kultivace kandid a sklíčkové nátěryVzorky stolice byly naředěny 1:10 fyziologickým roztokem, byly promíchány v homogenizátoru stolice a opět naředěny 1:1000 a 1:10000 fyziologickým roztokem. Sto mikrolitrů každého ředění bylo přeneseno na Candida CHROMagar (BBL) a bylo rovnoměrně naneseno sterilním tamponem. Po inkubaci při 37 °C po dobu 48 h na okolním vzduchu byly kolonie Candida spočítány a podle barvy kolonií klasifikovány jako C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis nebo jiné druhy Candida. Počet kolonií ⩾105 KTJ/ml stolice byl klasifikován jako „Candida overgrowth“ podle Danna et al. . Sklíčkový nátěr z každého ředění prvních 100 po sobě jdoucích vzorků stolice byl obarven Gramovým barvivem a byl vyšetřen světelnou mikroskopií na přítomnost kvasinek a leukocytů

Detekce SapsPoslední izoláty Candida ze skupin pacientů A-D- a A+D+ byly testovány na sekreci aspartylových proteináz v agaru s bovinním sérovým albuminem (BSA) (1,17% kvasničná uhličitá báze , 0,01% kvasničný extrakt a 0,2% BSA ), jak je popsáno jinde . Médium bylo upraveno na pH 5,0, bylo sterilizováno filtrací (velikost pórů 0,2 μm) a bylo přidáno k zásobnímu roztoku autoklávovaného (2%) agaru. Proteolýza, udávající enzymovou aktivitu, byla měřena v milimetrech a hodnocena, jak je uvedeno jinde: – nebo ± (nebylo přítomno žádné viditelné nebo velmi omezené projasnění agaru kolem kolonie), 1+ (byla pozorována znatelná proteolýza) a 2+ (projasnění agaru značně přesahovalo okraj kolonie). Jako kontroly byly vyšetřeny kmen C. albicans SC5314 a nulový mutant SAP2 (poskytl B. Hube, Univerzita Hamburk, Německo)

Statistická analýzaPočty pacientů s různými počty kandid v různých skupinách byly porovnány pomocí χ2 testu a počty kvasinek na sklíčkových nátěrech byly korelovány s počty kandid z kultur pomocí Pearsonovy korelace. Rozdíly v produkci Sap byly vypočteny pomocí Studentova t a Fisherova přesného testu. Velikost vzorku pro kultivační test byla vypočtena jako 91 hodnotitelných pacientů a pro Sap test byla vypočtena jako 20 hodnotitelných pacientů na skupinu, s α 0,05 a silou 0,8 (SigmaStat, verze 2.0; Jandel Scientific). Rozdíly s P<,05 byly považovány za významné

Výsledky

Kultivace kandid a stěry ze sklíčekVýsledky kultivace kandid jsou uvedeny na obrázku 1. Ve skupině A+D+ se pozitivita kandid (u 77/98 pacientů) a přerůstání kandid (u 62/98 pacientů) významně nelišily od skupiny A+D- (75/93 pacientů a 52/93 pacientů , v tomto pořadí). Ve skupině A-D+ bylo přerůstání kandid významně méně časté než ve skupině A+D+ (P=,003), ale pozitivita kandid se významně nelišila (P=,612). Pozitivita a přerůstání kandidy byly významně méně časté ve skupině A-D- než ve všech ostatních skupinách (pozitivita kandidy: 66/107 pacientů, P=,013, ve srovnání se skupinou A+D+; P=,005, ve srovnání se skupinou A+D-; a P=,002, ve srovnání se skupinou A-D+; přerůstání kandidy: 15/107 pacientů, P<.001, ve srovnání se všemi ostatními skupinami; obrázek 1)

Exploratorní analýzy s použitím různých mezních hodnot pro definici přemnožení rodu Candida (103, 104, 106 nebo 107 cfu/mL stolice) přinesly kvalitativně podobné výsledky. Ve všech výpočtech bylo přerůstání bakterií Candida významně méně časté ve skupině A-D- než ve všech ostatních skupinách. Nejčastějším izolátem byla C. albicans (216 z 395 pacientů), následovaná C. glabrata (104 z 395 pacientů), C. tropicalis (21 z 395 pacientů), C. krusei (11 z 395 pacientů) a jinými druhy Candida (97 z 395 pacientů). Smíšené kultury rodu Candida byly nalezeny u 122 (31 %) z 395 pacientů. Počty kvasinek na sklíčkových nátěrech nekorelovaly s počty z kultur (r=,27; obrázek 2)

Výsledky proteolytické aktivity na BSA agaruVšech 23 A+D+ a 20 A-D-Candida izolátů bylo testováno na proteolytickou aktivitu na BSA agaru. Průměrná±SD aktivita byla 1,26±1,06 mm pro skupinu A+D+ a 1,42±0,64 mm pro skupinu A-D-. Z 23 izolátů A+D+ mělo 16 skóre proteolýzy 1+ (zóna projasnění 1-2 mm) a 1 skóre 2+ (zóna projasnění 3-5 mm), což v obou případech naznačuje přítomnost proteolytické enzymové aktivity. Z 20 izolátů A-D- mělo 17 skóre proteolýzy 1+ a 2 skóre 2+. Všechny izoláty C. albicans vykazovaly na médiu BSA zóny projasnění (⩾1 mm, skóre ⩾1+). Ve skupině A-D- nevykazoval 1 izolát C. tropicalis žádnou proteolýzu. Ve skupině A+D+ nevykazovalo 5 izolátů C. glabrata a 1 izolát C. tropicalis žádnou proteolýzu. Clarifikační zóny skupiny A-D- a A+D+ se významně nelišily ani při měření v milimetrech (P=,568, Studentův t test), ani při použití systému hodnocení 1+/2+ (P=,294 a P=,590 pro izoláty s hodnocením 1+ a 2+, Fisherův přesný test) . Při odstranění izolátů C. glabrata (o kterých je známo, že jsou negativní na proteinovém agaru) nebyl mezi skupinami zjištěn žádný významný rozdíl v produkci Sap (P=,347)

Diskuse

Přerůstání kandidami bylo postulováno jako příčina AAD . Zkoumali jsme přítomnost a množství druhů Candida u pacientů s podezřením na AAD, u pacientů bez průjmu, ale užívajících antibiotika, u pacientů s průjmem, ale neužívajících antibiotika, a u pacientů bez průjmu a neužívajících antibiotika (kontrolní subjekty). Významně vyšší podíl vzorků stolice od pacientů užívajících antimikrobiální léčbu a trpících průjmem (skupina A+D+) byl pozitivní na druh Candida a měl vyšší počet kolonií než vzorky od kontrolních subjektů (skupina A-D-). Ve studii Danna et al. byl nadměrný růst Candida (⩾105 KTJ/ml stolice) pozorován u 7 (29 %) z 24 pacientů s AAD. V této studii mělo 0 z 24 pacientů bez průjmu, ale užívajících antibiotika, přerůstání Candida . V naší studii však mělo 52 (56 %) z 93 pacientů s antibiotiky, ale bez průjmu, přerůstání Candida a nebyl pozorován žádný rozdíl ve srovnání s pacienty s AAD. Vzhledem k tomu, že jsme vyšetřili téměř čtyřnásobný počet pacientů (93 vs. 24), mohou být rozdíly mezi našimi zjištěními a zjištěními Danny et al. způsobeny větší velikostí vzorku v naší studii

Pro posouzení vlivu průjmu na počet střevních bakterií rodu Candida jsme vyšetřili také pacienty, kteří nebyli léčeni antibiotiky, ale měli průjem (skupina A-D+). V této skupině bylo přemnožení Candida (⩾105 KTJ/ml stolice) významně méně časté než u pacientů s AAD, ale pozitivita Candida se významně nelišila. Předchozí studie ukázaly, že u pacientů s AAD byla normální flóra ve stolici výrazně snížena. Ve studiích, v nichž byl zkoumán vliv širokospektrých antibiotik na složení střevní mikroflóry lidí, byla pozorována významná inverzní korelace mezi logaritmem maximálního zvýšení kvasinek a logaritmem maximálního snížení anaerobů . Vzhledem k tomu, že jsme zjistili zvýšenou pozitivitu kandid u pacientů s AAD, A+D- a A-D+, předpokládáme, že pokles bakterií ve stolici, způsobený buď antibiotickou terapií, nebo zředěním při průjmech, umožnil expanzi druhů Candida, což vedlo ke zvýšení počtu pozitivních kandid

V naší studii průměrné počty kvasinek na nátěrech barvených Gramovým barvením nekorelovaly s kulturami kandid ani při přepočtu na celkový počet kvasinek na sklíčkových nátěrech (r=.27) ani s indexem navrženým Dannou et al. (r=,12). Rozpor mezi velkým počtem kvasinkových buněk spočítaných pod světelným mikroskopem a slabým nebo žádným růstem druhů Candida byl popsán jinde 15]. V této studii autoři předpokládali, že velká většina kvasinek ve stolici zjištěných pod mikroskopem nebyla živá . Naše výsledky naznačily, že při interpretaci vzorků stolice od pacientů s AAD a pozitivních na druh Candida je třeba postupovat s velkou opatrností. U těchto pacientů je vážně zpochybněna užitečnost analýzy stolice na počty kandid pomocí kultivace nebo sklíčkových nátěrů. Nepřítomnost leukocytů ve vzorcích obarvených Gramovým barvením byla v souladu s předchozími nálezy . Naše výsledky také potvrdily, že druhy Candida jsou součástí normální střevní flóry

Aktivní sekrece zprostředkovaná houbovým toxinem nebo látkami podobnými toxinu byla diskutována jako mechanismus AAD související s kandidami . Vzhledem k tomu, že Sapy jsou hlavními faktory virulence u infekcí způsobených bakteriemi rodu Candida , zkoumali jsme tyto proteinázy in vitro. Dosud bylo u C. albicans identifikováno 10 různých genů SAP . Protože bylo zjištěno, že Sap přispívá k poškození tkání v modelu lidské orální kandidózy , mohou tyto proteinázy poškozovat také střevní epiteliální buňky. U 8 pacientů s podezřením na AAD související s kandidami však nebyly zjištěny žádné známky kolitidy nebo buněčného poškození

V naší studii všechny zkoumané kmeny C. albicans produkovaly Sap a nebyl zjištěn žádný významný rozdíl mezi množstvím Sap produkovaných v izolátech Candida od pacientů s AAD a kontrolních subjektů. U dětí s akutním a chronickým průjmem byly zjištěny vyšší hladiny sekrečních kyselých proteináz rodu Candida než u zdravých kontrolních subjektů . Ačkoli hladiny Sap vypočtené pro celou skupinu dětí s akutním nebo chronickým průjmem byly významně vyšší než hladiny u kontrolních subjektů, v jednotlivých případech tomu tak nebylo. Z 9 izolátů Candida měly 4 z kontrolních subjektů (děti bez průjmu) hladiny Sap srovnatelné s hladinami u dětí s chronickým průjmem a 2 z 9 kontrolních subjektů měly hladiny srovnatelné s hladinami u dětí s akutním průjmem. Navzdory těmto vysokým hladinám Sap neměly kontrolní subjekty průjem. To kontrastuje s výsledky předchozích studií, v nichž produkce Sap u symptomatických pacientů dosahovala vždy vyšších hladin než u kontrolních subjektů: Kmeny Candida z ústní kandidózy u pacientů s AIDS produkovaly ∼8krát více Sap než izoláty od kontrolních subjektů

Produkce Sap je shodně indikována testem na agaru BSA a metodou ELISA . Navíc vysoké hladiny Sap vylučované in vitro a detekované pomocí BSA agaru nebo ELISA korelovaly se zvýšenými hladinami Sap in vivo (např. ve vaginálních tekutinách pacientů s HIV pozitivní vaginitidou) . Lze spekulovat o tom, že Candida species dočasně produkuje vysoké hladiny Sap in vivo, ale ztrácí tuto schopnost např. v důsledku subkultivace. U C. albicans izolované z ústní dutiny bylo prokázáno, že zvýšená produkce Sap je stabilní charakteristikou. Na druhou stranu izoláty C. albicans s nízkou produkcí proteináz vykazovaly stabilní nízkou produkci Sap při opakovaných subkulturách

V souhrnu výsledky naší studie nepotvrzují dříve předpokládané patogenetické mechanismy AAD související s kandidami . Naše údaje naznačují, že zvýšené počty kandid jsou spíše důsledkem léčby antibiotiky nebo průjmu jako takového než příčinou AAD. Produkce hlavního houbového virulenčního faktoru Sap u pacientů s AAD se nelišila od produkce u kontrolních subjektů, což naznačuje, že tento houbový toxin nemusí být zodpovědný za AAD u dospělých. Ostatní houbové faktory virulence (např. phospholipases) warrant further investigation