Buněčná biologie@Yale

Obsah přednášky

Membránově vázané organely

Eukaryotické buňky obsahují soubory proteinů, které fungují jako jednotka zvaná organely. Některé z těchto organel jsou obklopeny membránou s podobnou strukturou jako buněčná membrána, ale s odlišným složením bílkovin a fosfolipidů.

Membránově vázané organely poskytují eukaryotickým buňkám několik výhod. Zaprvé mohou buňky koncentrovat a izolovat enzymy a reaktanty v menším objemu, čímž se zvyšuje rychlost a účinnost chemických reakcí. Za druhé, buňky mohou v membránově vázaných organelách uzavřít potenciálně škodlivé proteiny a molekuly a chránit tak zbytek buněk před jejich škodlivými účinky. Například lysozom, který je membránově vázanou organelou, obsahuje mnoho enzymů, které tráví bílkoviny, nukleové kyseliny a lipidy. Pokud by se tyto enzymy uvolnily do cytosolu, mohly by rozžvýkat proteiny, nukleové kyseliny a lipidy buňky, což by vedlo k její smrti. Membrána obklopující lysozom udržuje tyto trávicí enzymy mimo zbytek buňky.

Mikrotubulární organizace cytoplazmy

Organely a bílkoviny obvykle nejsou v buňce rozmístěny náhodně, ale jsou organizovány tak, že jsou lokalizovány do oblastí, kde jsou potřeba. Buňka využívá k lokalizaci organel mikrotubuly a motorické proteiny. Mikrotubuly jsou dlouhá vlákna, která se táhnou po celé cytoplazmě. Dva typy motorických proteinů, kineziny a dyneiny, se pohybují podél mikrotubulů a vytvářejí sílu, která táhne organely cytoplazmou.

Mikrotubuly jsou polymery heterodimeru tubulinu alfa a beta. Tubulin polymeruje do lineárních protofilament a mikrotubulus obsahuje 13 protofilament uspořádaných do válce s dutým jádrem. Mikrotubuly jsou polarizovány na minusový a plusový konec. Mikrotubuly rostou ze svého plusového konce přidáváním dalších tubulinových podjednotek. Mínusové konce mikrotubulů jsou nestabilní a jsou stabilizovány proteiny v centru organizujícím mikrotubuly (MTOC). Pokud se MTOC nachází ve středu buňky, mikrotubuly vyzařují svými plusovými konci směrem ven k plazmatické membráně

Kineziny a dyneiny se pohybují po mikrotubulech s využitím energie z hydrolýzy ATP. Obě sady proteinů obsahují motorické domény, které vážou mikrotubuly a hydrolyzují ATP. Motorické domény vytvářejí pohyb podél mikrotubulů. Většina kinezinů se pohybuje směrem k plusovému konci mikrotubulů, zatímco dyneiny se pohybují směrem k minusovému konci. Buňky tak mají k dispozici dva nástroje k řízení rozmístění organel podél mikrotubulů. Kinezíny a dyneiny také obsahují doménu vázající náklad, která je spojuje s různými organelami. Kineziny tvoří velkou rodinu proteinů a doména vázající náklad je nejodlišnější, což umožňuje různým členům rodiny kinezinů vázat různé organely. Dynein je velký komplex několika proteinů a způsob, jakým váže náklad, je méně jasný.

Aktinová vlákna také podporují transport buněčného materiálu, ale na mnohem kratší vzdálenosti než mikrotubuly. Aktinová vlákna jsou tvořena polymerem aktinu, což je malý globulární protein. Aktinová filamenta jsou šroubovice aktinu a podobně jako mikrotubuly mají plusový a minusový konec, přičemž filamenta rostou snadněji ze svých plusových konců. Aktinová vlákna postrádají rozsáhlé laterální kontakty jako mikrotubuly a jsou obvykle mnohem kratší než mikrotubuly. Aktinová filamenta mají tendenci se lokalizovat v blízkosti buněčné membrány, kde poskytují strukturální podporu.

Myoziny jsou třídou motorických proteinů, které mohou vytvářet sílu podél aktinových filament. Některé myoziny se podílejí na buněčné kontrakci (tj. kontrakci svalů), zatímco jiné podporují pohyb a polohu organel. Myosiny třídy V se podílejí na transportu organel v několika různých typech buněk. Podobně jako struktura kinezinu obsahují myosiny třídy V motorickou doménu, která se váže na aktinová vlákna a využívá energii hydrolýzy ATP k pohybu po vláknech. Konec C myozinu V váže organely.

K transportu a umístění organel buňky často používají jak mikrotubuly, tak aktinová vlákna. Mikrotubuly, kineziny a dyneiny se používají k přesunu organel na dlouhé vzdálenosti (několik mikrometrů a více), zatímco aktinová vlákna transportují organely na krátké vzdálenosti (např. v blízkosti plazmatické membrány). Často se stává, že organela obsahuje více než jeden typ motorického proteinu (např. kinezin a myozin V), aby buňky mohly využít obě sady filament k umístění organely.

Signální sekvence

Pro zachování identity a funkce různých organel a plazmatické membrány potřebují buňky zaměřit specifické proteiny na organely a další intracelulární kompartmenty. Většina těchto proteinů obsahuje krátkou sekvenci, nazývanou signální sekvence, která určuje jejich intracelulární umístění. Signální sekvence mohou být lokalizovány kdekoli v proteinu, ale často se nacházejí na N-konci. Signální sekvence, které směřují proteiny do stejné organely, často nesdílejí stejnou primární sekvenci. O tom, zda sekvence cílí proteiny do organely, obvykle rozhodují celkové biochemické vlastnosti sekvence. Signální sekvence se používají k importu rozpustných proteinů i integrálních membránových proteinů.

Import proteinů do organel vázaných na membránu

Protože membrány, které obklopují organely, omezují průchod proteinů, vyvinuly organely různé mechanismy pro import proteinů z cytoplazmy. Většina organel obsahuje sadu membránových proteinů, které tvoří póry. Tento pór umožňuje průchod proteinů se správnou signální sekvencí. Některé póry (ER, mitochondrie) mohou pojmout pouze nesložené proteiny, zatímco jiné póry (jádro, peroxizom) umožňují průchod složených proteinů.

Cílení proteinů do endoplazmatického retikula

Proteiny určené pro sekreci, plazmatickou membránu nebo jakoukoli organelu sekreční cesty se nejprve vloží do ER. Většina proteinů přechází přes ER ko-translačně, protože je syntetizována ribozomy na ER. Jak rozpustné proteiny (proteiny, které se nacházejí v lumen organel nebo jsou vylučovány), tak integrální membránové proteiny jsou zaměřeny na ER a přemísťovány stejným mechanismem.

Signální sekvence pro proteiny ER se obvykle nachází na N-konci. Signální rozpoznávací částice (SRP), komplex 6 proteinů a jedné RNA, váže signální sekvenci ihned po jejím překladu. SRP také interaguje s ribozomem a zastaví translaci. Povrch membrán ER obsahuje receptor pro SRP. Receptor SRP rekrutuje SRP, vznikající protein ER a ribozom do ER. Receptor SRP uvolní SRP ze signální sekvence a umožní pokračování translace na membráně ER.

Ribosomy na membráně ER se vážou na proteinový translokátor. Translokátor je transmembránový protein, který tvoří vodní pór. Pór je kanál, kterým se nově syntetizované proteiny ER přemístí přes membránu ER. Translace proteinu ER vytváří „sílu“, která protlačí protein ER kanálem.

Rozpustné proteiny jsou kompletně translokovány kanálem; signální sekvence zůstává v kanálu a je odštěpena od zbytku proteinu proteázou v lumen ER.

Integrální membránové proteiny obsahují stop přenosovou sekvenci za signální sekvencí. Stop přenosová sekvence ukončí translokaci kanálem a část proteinu za stop přenosovou sekvencí se nachází mimo ER. Integrální membránové proteiny mohou být přemístěny tak, že se jejich N-konec nebo C-konec nachází v lumen ER. Proteiny s C-koncem v lumen mají tendenci mít vnitřní signální sekvenci. Zdá se, že translokátor se otevírá na jedné straně, aby umožnil integrálním membránovým proteinům difundovat do okolní lipidové dvojvrstvy.

Některé proteiny překlenou membránu několikrát a tyto proteiny obsahují po stop přenosové sekvenci start přenosovou sekvenci, která znovu iniciuje translokaci proteinu kanálem. Protein se signální sekvencí, stop přenosem a start přenosem by překlenul membránu dvakrát, přičemž smyčka by se nacházela v cytosolu nebo lumen. K vytvoření proteinů, které překlenou membránu několikrát, by protein potřeboval několik střídajících se stop a start přenosových sekvencí.

Jakmile proteiny vstoupí do ER, složí se do svých trojrozměrných struktur. Existuje několik mechanismů, které pomáhají proteiny skládat, včetně chaperonů a glykosylace. ER obsahuje také mechanismy, které si poradí s proteiny, které se nepodaří složit.

Cílení proteinů do mitochondrií

Ačkoli mitochondrie obsahují vlastní genom, většina mitochondriálních proteinů je kódována jadernými geny, což vyžaduje mechanismus pro cílení a import těchto proteinů do mitochondrií. Podobně jako proteiny importované do ER obsahují mitochondriální proteiny signální sekvenci, která je do mitochondrií zaměřuje. Na rozdíl od proteinů ER jsou mitochondriální proteiny importovány posttranslačně. Protože bílkoviny musí být rozložené, aby se mohly přemístit přes kanály v mitochondriální membráně, jsou mitochondriální bílkoviny udržovány rozložené v cytosolu pomocí chaperonů.

Inport bílkovin do mitochondrií je podobný importu do ER, ale je komplikován přítomností dvou membrán kolem mitochondrií. Mitochondriální proteiny se mohou nacházet ve vnější membráně, vnitřní membráně, mezimembránovém prostoru nebo matrix (prostor uvnitř vnitřní membrány). mitochondrie tedy mají translokátory, které umožňují průchod proteinů přes vnější membránu a přes vnitřní membránu. Komplex TOM zprostředkovává průchod přes vnější membránu, zatímco komplex TIM zprostředkovává průchod přes vnitřní membránu.

Translokace proteinů do mitochondrií

Signální sekvence, která cílí proteiny do matrix, se obvykle nachází na N-konci. Signální sekvence je rozpoznávána proteiny v komplexu TOM. Komplex TOM předá proteiny do prostoru vnitřní membrány, kde komplex TIM ve vnitřní membráně předá protein do matrix. Komplexy TOM a TIM často spolupracují při translokaci proteinu přes obě membrány. Translokace přes mitochondriální membrány je závislá na energii. Chaperony v matrix pomáhají „přetáhnout“ protein přes vnitřní membránu a ke své funkci vyžadují hydrolýzu ATP. Proteiny se skládají uvnitř matrice.

Proteiny zaměřené na vnitřní membránu používají podobný mechanismus jako proteiny matrice, ale obsahují stop přenosovou sekvenci rozpoznávanou komplexem TIM. Proteiny cílené na vnější membránu jsou přesunuty přes vnější membránu do mezimembránového prostoru a poté importovány do vnější membrány pomocí translokátoru SAM. Proteiny určené pro mezimembránový prostor jsou částečně vloženy do vnitřní membrány a poté rozštěpeny proteázou a uvolněny do prostoru vnitřní membrány.

Import a export jaderných proteinů

Na rozdíl od ER a mitochondrií jádro importuje především rozpustné proteiny. Kromě toho proteiny často přechází mezi jádrem a cytoplazmou a buňka využívá jaderný import/export k regulaci několika kritických biochemických drah. Jádro je obklopeno dvěma membránami a v těchto membránách jsou zabudovány tisíce jaderných pórů, kterými do jádra vstupují a vystupují proteiny a další makromolekuly (RNA, ribosomy). Jaderné póry jsou v membránách stabilizovány laminami, cytoskeletální sítí, která je podkladem vnitřní jaderné membrány a poskytuje jí strukturální oporu. Jaderný pór omezuje průchod materiálu na základě velikosti: věci menší než ~ 30 kD volně difundují přes pór, ale velké molekuly potřebují způsob, jak se dostat dovnitř a ven. Proteiny, které se pohybují do jádra, obsahují jaderný importní signál a ty, které musí jádro také opustit, obsahují jadernou exportní sekvenci.

Rozlišení cytoplazmy od nukleoplazmy

Pro vytvoření řízeného transportu proteinů do jádra a z jádra musí proteiny vědět, zda se nacházejí v cytoplazmě nebo uvnitř jádra. K rozlišení jádra a cytoplazmy používají buňky malý protein vážící GTP zvaný Ran. Jako všechny GTP-vázající proteiny existuje Ran buď ve stavu vázaném na GTP, nebo ve stavu vázaném na GDP. Přepínání mezi těmito stavy katalyzují dva proteiny. Ran-GAP (GTPase activating protein) katalyzuje hydrolýzu GTP za vzniku Ran-GDP. Ran-GEF (guanin nukleotid exchange factor) katalyzuje uvolnění GDP a opětovnou vazbu GTP, čímž vzniká Ran-GTP. Ran-GAP se lokalizuje na cytoplazmatické straně jaderných pórů, zatímco Ran-GEF se spojuje s chromatinem, a proto se lokalizuje v jádře. Výsledkem je, že většina Ran v jádře je vázána na GTP a většina Ran v cytoplazmě je vázána na GDP.

Jaderný import

Receptory (importiny) vážou sekvence jaderného importu v proteinech. Importiny také interagují s filamenty, která vystupují z cytoplazmatické strany jaderných pórů. Neznámým mechanismem importiny navázané na svůj náklad procházejí jaderným pórem. Uvnitř póru se komplex importin-náklad setkává s Ran-GTP. Ran-GTP disociuje importiny od nákladu a uvolní nákladové proteiny, aby mohly vykonávat svou práci v jádře.

Jaderný export

Mnoho proteinů, které vstupují do jádra, musí být exportováno do cytoplazmy (např. importiny). Tyto proteiny obsahují sekvenci pro jaderný export, která interaguje s receptorem zvaným exportin. Ran-GTP se váže na tento komplex exportin-náklad a stabilizuje interakci. Komplex exportin-kargo-RanGTP prochází pórem (mechanismus není jasný), kde se na cytoplazmatické straně setkává s Ran-GAP. Ran-GAP přemění Ran-GTP na Ran-GDP a způsobí disociaci exportinu od jeho nákladu.

Import proteinů do peroxizomů a Zellewegerův syndrom

Peroxisomy jsou malé organely (~ 1 µm v průměru), které pro buňky plní řadu funkcí. Peroxisomy metabolizují škodlivé chemické látky (fenoly, formaldehyd, etanol), metabolizují mastné kyseliny a katalyzují krok v syntéze plasmalogenu, což je lipid, který se nachází v myelinu.

Proteiny určené pro peroxisomy obsahují signální sekvenci, která je rozpoznávána rodinou proteinů zvaných Pex proteiny. Některé z těchto proteinů Pex se vážou na signální sekvence, zatímco jiné na pór v membráně peroxizomů, který umožňuje vstup proteinů do peroxizomů.

Buňky, které obsahují mutace v proteinech Pex, nemohou importovat proteiny do peroxizomů, a proto tyto buňky postrádají peroxizomy. Mutace v proteinech Pex jsou spojeny se souborem onemocnění zvaných Zellewegerův syndrom. U Zellewegerova syndromu chybí kojencům svalový tonus a často i schopnost sát. Kojenci také vykazují kraniofaciální abnormality a zvětšená játra. Prognóza kojenců trpících Zellewegerovým syndromem je špatná a většina z nich nepřežije déle než jeden rok.

Protože se peroxizomy podílejí na syntéze lipidu obsaženého v myelinu, pacienti se Zellewegerovou chorobou často vykazují slabou myelinizaci neuronů. Myelinizace je rozhodující pro funkci neuronů při vedení signálů k cílovým buňkám.