Dlouhodobé zvýšení hmotnosti a síly kosterního svalstva jednorázovým podáním genových inhibitorů myostatinu

Výsledky a diskuse

Dodání genu do svalu pomocí AAV poskytuje systém pro tvorbu vysokých hladin proteinu v cílové tkáni nebo prostřednictvím vylučovaného produktu přenášeného oběhem na vzdálená místa (19). Do sérotypu 1 AAV jsme klonovali známé sekreční geny inhibující myostatin, včetně sérového proteinu-1 asociovaného s růstovým a diferenciačním faktorem (GASP-1) (18), genu souvisejícího s follistatinem (FLRG) (17) a follistatinu-344 (FS) (13), které prokázaly vysokou schopnost transdukce do svalu. Existují dvě izoformy follistatinu, které vznikají alternativním sestřihováním. Varianta FS-344 podléhá peptidovému štěpení, čímž vzniká izoforma FS-315, a druhá varianta FS-317 vytváří po peptidovém štěpení izoformu FS-288. Použili jsme lidskou variantu FS-344, která generuje výhradně cirkulující izoformu FS-315 v séru a obsahuje C-koncovou kyselou oblast (20). Zvolili jsme FS-344 (FS), protože druhá izoforma FS-317, která postrádá C terminus, vykazuje preferenční lokalizaci do ovariální folikulární tekutiny a vysokou afinitu k vazbě na tkáně prostřednictvím heparin sulfátových proteoglykanů, což může ovlivnit reprodukční schopnost a vázat se na další necílová místa (21). FS-288 představuje membránově vázanou formu follistatinu (22), je silným supresorem hypofyzárního folikulostimulačního hormonu (23), nachází se ve folikulární tekutině vaječníků a ve varlatech a vykazuje vysokou afinitu k granulózovým buňkám vaječníků.

Snažili jsme se určit účinnost těchto proteinů na zvýšení svalové hmoty u normálních a dystrofických myší. Podali jsme 1 × 1011 virových částic AAV1 na zvíře kódujících FS, FLRG, GASP-1 nebo GFP bilaterálně do čtyřhlavého svalu stehenního a předního svalu holenního čtyřtýdenních myší C57BL/6 divokého typu. Všechna zvířata léčená inhibitory myostatinu vykazovala nárůst tělesné hmotnosti s pozorovatelným hrubým zvětšením svalů při analýze ve věku 725 dní ve srovnání s kontrolami léčenými GFP (obr. 1 a a b). Hodnocení hmotnosti jednotlivých svalů ukázalo nárůst svalové hmoty u všech zvířat léčených inhibitory myostatinu, s největším nárůstem u zvířat léčených FS. Zvýšená svalová hmota byla zjištěna ve svalech zadní končetiny, do kterých byla injekce aplikována, a ve svalech vzdálených od místa injekce, jako je triceps. Tyto inhibitory se tedy vylučovaly do oběhu z místa injekce do svalu a zvyšovaly hmotnost kosterního svalstva na vzdálených místech (obr. 1 c). Zvětšená svalová hmota byla doprovázena funkčním zlepšením, které se projevilo zvýšením síly úchopu zadních končetin (obr. 1 d). Nebyl pozorován žádný vliv na hmotnost srdce ani na histologický vzhled kardiomyocytů, což naznačuje, že inhibice myostatinu byla selektivní pro kosterní svalovou tkáň (údaje nejsou uvedeny). Existují obavy, že FS nepříznivě ovlivňuje funkci gonád. U myší léčených naším AAV1 nesoucím transgen FS344 (AAV1-FS, tabulka 1) jsme nezjistili žádnou změnu reprodukční schopnosti Kromě toho jsme nezjistili žádné histologické/patologické změny v gonadální tkáni myší léčených FS ve srovnání s kontrolami (údaje nejsou uvedeny).

Vzhledem k silným účinkům podání FS jsme dále testovali potenciál AAV1-FS podaného postnatálně v klinicky významném paradigmatu ke zvýšení svalové hmoty a síly a oddálení zhoršení stavu svalů u myšího modelu mdx Duchennovy svalové dystrofie (DMD). DMD je recesivní onemocnění vázané na chromozom X, které vede k úbytku kosterních svalů a srdeční funkce, což nakonec vede ke smrti. Nedávno byla FS zkoumána u mdx zvířat s nadměrnou expresí duplikované domény genu pro follistatin. Výsledky prokázaly zvýšení svalové hmoty a zmírnění patologie, i když výsledky byly doloženy pouze do 15 týdnů věku (24). V našich studiích byla mdx zvířatům oboustranně do čtyřhlavého svalu stehenního a předního svalu holenního injikována nízká (1 × 1010 virových částic) nebo vysoká dávka (1 × 1011 virových částic) AAV1-FS ve věku 3 týdnů a sledována po dobu 5 měsíců před nekropsií. V séru zvířat léčených nízkou i vysokou dávkou byly zjištěny zvýšené hladiny cirkulujících FS, přičemž vysoká dávka vykazovala nejvyšší hladiny zjištěných FS v séru (vysoká dávka, 15,3 ± 2,1 ng/ml; nízká dávka, 6,8 ± 0,4 ng/ml; kontroly GFP, 0 ± 0,1 ng/ml; n = 8 na skupinu; P < 0,01). Prokázali jsme, že AAV1-FS zvýšil tělesnou hmotnost ve srovnání s kontrolami ošetřenými GFP, přičemž největší nárůst byl ve skupině s vysokou dávkou FS (údaje nejsou uvedeny). Hrubé pozorování myší ošetřených AAV1-FS vykazovalo významné zvětšení velikosti svalů ve srovnání se zvířaty ošetřenými AAV1-GFP (obr. 2 a), přičemž největší nárůst hmotnosti jednotlivých svalů byl u zvířat ošetřených vysokou dávkou FS (obr. 2 b). Účinky se neomezovaly pouze na injikované svaly; byly zjištěny i v místech vzdálených od přímo cílených svalů (obr. 2 b). Zvýšení svalové hmoty se promítlo do zlepšení svalové síly v závislosti na dávce u zadních a předních končetin ošetřených zvířat ve srovnání s kontrolami ošetřenými GFP (obr. 2 c). Histologické a morfometrické analýzy svalů injektovaných AAV1-FS a na vzdálených místech prokázaly hypertrofii myofibry, což podporuje hrubá pozorování provedená v době nekropsie (obr. 3 a-c). U zvířat ošetřených AAV-FS navíc nedošlo k žádnému posunu v typech svalových vláken; u zvířat ošetřených vysokou dávkou AAV-FS však bylo v předním svalu holenním méně celkového počtu vláken na milimetr čtvereční plochy (obr. 3 d a e). Pozoruhodné je, že myši léčené FS vykazovaly významné snížení sérové kreatinkinázy ve srovnání s kontrolami léčenými GFP (obr. 4 a). To je zajímavé, protože FS byla protektivní navzdory tomu, že nevedla ke korekci základního deficitu dystrofinu. Přesný mechanismus není jasný, ale lze spekulovat, že zvýšení pevnosti jednotlivých vláken je činí méně náchylnými k poškození v důsledku zátěže při běžných činnostech. Zapojení satelitních buněk do postnatální inhibice myostatinu ještě není zcela vyřešeno, nicméně u zvířat léčených FS jsme nezaznamenali statistickou změnu markerů svalových satelitních buněk (údaje nejsou uvedeny).

Vyhodnotili jsme také potenciál AAV1-FS zvýšit svalovou sílu u mdx zvířat při léčbě ve vyšším věku. Zjistili jsme, že injekce AAV1-FS ve věku 210 dní zvýšila svalovou sílu ≈60 dní po podání a že zvýšená síla přetrvávala dlouhodobě po celých 560 dní hodnocených v této studii (obr. 4 b). Již ve 180 dnech věku, tedy před podáním AAV1-FS, byla ve svalech neléčených mdx zvířat patrná patologie s výraznou proliferací endomyziální pojivové tkáně a zánětem (obr. 4 c a d). Patologické hodnocení svalů gastrocnemia a bránice ve věku 560 dní prokázalo, že zvířata léčená AAV1-FS měla podstatně méně fokálních skupin nekrotických svalových vláken a infiltrátů mononukleárních buněk. Důležité je, že zvířata ošetřená AAV1-FS měla podstatně méně fokálních oblastí endomyziální proliferace pojivové tkáně, které byly výrazné u zvířat ošetřených GFP, což ukazuje, že fibróza, charakteristický znak svalové dystrofie, byla u zvířat ošetřených FS snížena (obr. 4 c). Patologie v bránici také ukázala, že léčba FS snížila zánět a tukovou náhradu ve srovnání se zvířaty léčenými GFP (obr. 4 d). Kromě toho léčba AAV1-FS prokázala v tomto věku významné zvýšení průměru svalových vláken ve srovnání s kontrolními zvířaty léčenými GFP (obr. 4 c a d). Tyto výsledky prokázaly, že inhibice myostatinu léčbou FS byla prospěšná u starých mdx zvířat, která prošla několika koly svalové degenerace a regenerace. Převedení do klinické paralely naznačuje, že genová terapie pomocí AAV zprostředkovaná FS by mohla mít potenciál pro starší pacienty s DMD nezávisle na náhradě chybějícího genu a mohla by mít potenciální roli v kombinované terapii podobně, jak bylo prokázáno u náhrady genů IGF-1 a minidystrofinu (25).

Tyto výsledky naznačují, že inhibice myostatinu pomocí FS-344 podávaná jednou injekcí AAV1 může zvýšit velikost a sílu svalů a je dobře tolerována po dobu >2 let. Výsledky FS344 mohou nabízet účinnější strategii než jiné strategie zaměřené výhradně na myostatin, a to díky aditivním účinkům, jako je zapojení follistatinu do více signálních drah, a nedávnému zjištění prokazujícímu snížení zánětu v modelu endotoxémie (15, 26). Nápadná schopnost FS zajistit hrubé a funkční dlouhodobé zlepšení dystrofických svalů u starších zvířat opravňuje ke zvážení jeho klinického vývoje pro léčbu muskuloskeletálních onemocnění, včetně starších pacientů s DMD.