PMC

Tato přednáška vychází z nedávného přehledu.

Zvyšující se celosvětová zátěž cukrovkou je dobře známá a dopady na náklady na zdravotní péči a na lidské utrpení, nemocnost a úmrtnost se projeví především v rozvojových zemích včetně Indie, Číny a zemí v Africe. Nové léky jsou vyvíjeny rychlým tempem a v posledních několika letech se objevilo několik nových tříd látek pro léčbu diabetu, např. mimetika glukagonu podobného peptidu (GLP-1), inhibitory dipeptidyl-peptidázy-4 (DPP-4), inhibitory sodíkového glukózového transportéru-2 (SGLT2). Nové chirurgické postupy jsou také stále dostupnější a obhajované jako účinná léčba diabetu. V posledních letech byly zavedeny chirurgická omezení žaludku, žaludeční bypass, současná transplantace slinivky a ledvin, transplantace slinivky a ostrůvků. Aby se předešlo traumatu velké operace, bylo provedeno mnoho studií o transplantaci izolovaných ostrůvků odebraných z kadaverózní slinivky. Povzbuzením byl „edmontonský protokol“ popsaný Shapirem a jeho kolegy v časopise New England Journal v roce 2000. Ostrůvky byly aplikovány do portální žíly a pacienti, zejména ti, kteří trpěli nebezpečnou hypoglykemickou nevědomostí, byli léčeni dříve, než se u nich rozvinuly závažné komplikace diabetu, zejména renální komplikace. Zatímco první výsledky byly slibné a přibližně 70 % pacientů po dvou letech nepotřebovalo žádné injekce inzulinu, po pěti letech se stav většiny těchto pacientů zhoršil a vyžadovali doplňování inzulinu, přestože někteří z nich dostali více než jednu transplantaci ostrůvků. V novější sérii pacientů zaznamenala edmontonská skupina lepší dlouhodobé výsledky při použití monoklonální protilátky proti lymfocytům Campath 1H podávané jako indukční látka, přičemž 45 % pacientů bylo po pěti letech nezávislých na inzulínu a 75 % mělo detekovatelný C-peptid.

Kadaverózní pankreaty a ostrůvky však soutěží o stejný zdroj a jejich počet je omezený, a tak ani jednu z těchto léčebných metod nebylo možné snadno nabídnout naprosté většině diabetických pacientů. Někteří se pokoušeli použít alternativní zdroj, například zapouzdřené ostrůvky z novorozených nebo dospělých prasat. To je zatím velmi experimentální a bude to vzdálená alternativa s mnoha technickými a možná i etickými překážkami, které je třeba překonat.

V poslední době, kdy se podařilo vyvinout pluripotentní dospělé kmenové buňky (od Yamanaky, který v roce 2012 získal Nobelovu cenu za medicínu za vývoj indukovaných pluripotentních kmenových buněk – iPSC), se objevily pokusy o nové přístupy k hledání metod, které by mohly být dostupnější a přístupnější. Velké naděje se zpočátku vkládaly do výzkumu embryonálních kmenových buněk (ESC), protože tyto buňky lze přesvědčit, aby se množily a vyvinuly v jakoukoli tkáň, ale tento proces byl nákladný a problém tvorby teratomů z těchto kmenových buněk se ukázal jako velmi obtížně překonatelný. Mnoho důležitých faktorů souvisejících s vývojem plodu není známo a nelze je reprodukovat. Přesto se podařilo dosáhnout určitého pokroku a (příležitostně) přesvědčit buňky, aby vylučovaly inzulín, ale zatím došlo jen k minimálnímu terapeutickému využití.

Vědci si nyní uvědomují, že přesvědčit buňku, aby produkovala inzulín, je jen jeden krok na cestě, která může být dlouhá a obtížná. Buňky ostrůvků jsou vysoce specializované na to, aby měly nejen základní uvolňování inzulínu, ale také aby rychle reagovaly na změny koncentrace glukózy v krvi. U inzulinu je proces a regulace vypnutí sekrece stejně důležitý jako zapnutí sekrece.

Byla provedena řada přístupů s různými východisky. Kmenová buňka se sama reprodukuje a může se pak také asymetricky dělit a vytvořit jiný typ buňky: Tomu se říká diferenciace. Ačkoli se původně předpokládalo, že jsou k dispozici pouze z embryí, neembryonální kmenové buňky lze nyní bez větších obtíží získat z novorozenecké tkáně, pupečníku a také z různých tkání dospělých včetně kostní dřeně, kůže a tuku. Tyto kmenové buňky lze expandovat a diferencovat, ale jejich repertoár je ve srovnání s embryonálními kmenovými buňkami omezený: oligo- nebo pluri- na rozdíl od toti-potentních embryonálních kmenových buněk. Ještě více je v poslední době velký zájem o proces přímé buněčné trans-diferenciace, při níž se angažovaná a plně diferencovaná buňka, například jaterní buňka, mění přímo na jiný buněčný typ, například na beta-buňku ostrůvku, aniž by došlo k indukci de-diferenciace zpět do stadia kmenové buňky.

Yamanaka v roce 2006 dokázal vytvořit pluripotentní kmenové buňky z myších neonatálních a dospělých fibroblastových kultur přidáním koktejlu čtyř definovaných faktorů. To vedlo k řadě dalších studií rozvíjejících tento proces, který se ukázal jako opakovatelný s lidskou tkání i laboratorními myšmi. Použití iPS buněk se vyhnulo etickým omezením spojeným s použitím lidských embryí, ale přesto se vyskytly další problémy a překážky. Objevily se zprávy o tom, že se iPS buňky stávají antigenními vůči autolognímu nebo izolognímu hostiteli, a buňky mohou hromadit abnormality DNA a dokonce si zachovávat epigenetickou paměť původního typu buněk, a mají tak tendenci se vracet zpět. Stejně jako embryonální kmenové buňky mohou iPS buňky vytvářet teratomy, zejména pokud diferenciace není úplná.

Přes to se zatím jen velmi málo daří usměrnit diferenciaci iPSC tak, aby vytvářely ostrůvkové beta-buňky v dostatečném množství, které budou vylučovat a zastavovat sekreci v reakci na změny hladiny glukózy v krvi.

Dalším přístupem, který byl vyzkoušen, je kombinace genové terapie s kmenovými buňkami. Určitého pokroku bylo dosaženo ve snaze exprimovat požadovaný inzulínový gen v primitivnějších nediferencovaných buňkách pomocí ovlivnění kmenových buněk diferenciačními faktory in vitro a následně přímou transfekcí genu pomocí plazmidů nebo virového vektoru. My i jiní jsme použili konstrukt lidského inzulínového genu a zavedli jej ex vivo nebo in vivo do buněk přímou elektroporací (zřejmě v buňkách ex vivo) nebo pomocí virových vektorů. Nejvíce byly studovány adenoviry, adenoasociované viry a různé retro viry, zejména lentivirus. Jakýkoli typ genetického inženýrství však vyvolává obavy nejen z infekce virem, ale také z demaskování onkogenů, což vede k malignitám, a existují přísné předpisy, jak postupovat, aby se těmto rizikům předešlo.

Zajímali jsme se o pupečníkové kmenové buňky a mezenchymální kmenové buňky jako cíle pro kombinovanou kmenovou a genovou terapii. Tyto buňky lze poměrně snadno a reprodukovatelně získat z jinak vyřazeného pupečníku nebo snadno dostupné kostní dřeně, přičemž buňky se vyselektují pomocí různých standardních technik. Zdrojem, z něhož lze získat meznechymální kmenové buňky, je také tuk, amnion a pupečníková krev. Po proliferační fázi získají buňky vzhled podobný koberci fibroblastů, které se mohou diferencovat v kostní, chrupavčité nebo tukové buňky. Ačkoli mezenchymální kmenové buňky z různých zmíněných zdrojů mohou vypadat podobně, jejich diferenciační potenciál je idiosynkratický a liší se, proto je nevhodné a obtížné považovat je za jednotný zdroj cílových buněk. Buňky novorozeneckého amnionu a pupečníkové buňky mají nízkou imunogenicitu a neexprimují antigeny HLA II. třídy. Vylučují také faktory, které inhibují imunitní reakce, například rozpustný HLA-G. I když je jejich imunogenicita výrazně snížena, stále nejsou autologní, a proto přetrvává riziko odmítnutí alotransplantátu. Jejich výhodou je, že by se mohly množit, zmrazovat a uchovávat ve velkém množství a mohly by se používat u pacientů, kteří již potřebují imunosupresiva, například u pacientů po transplantaci ledviny.

V Singapuru naše studie s amnionovými buňkami odvozenými z pupečníku prokázaly určitý úspěch v tom, že mají expresi genů pro inzulin a glukagon, ale in vitro vylučují inzulin jen málo nebo vůbec. Spolu s transfekcí inzulínových genů in vitro došlo po peritoneální transplantaci do myší s diabetem vyvolaným sterptozotocinem k určitému zlepšení hladiny glukózy. Naši kolegové v Singapuru použili další model autologních hepatocytů ze streptozotocinem indukovaných diabetických prasat. Tyto separované hepatocyty byly úspěšně transfekovány ex vivo konstruktem lidského inzulínového genu pomocí elektroforézy a poté byly buňky pomocí několika samostatných injekcí injikovány přímo zpět do jaterního parenchymu. Prasata byla vyléčena z cukrovky až na devět měsíců – což je pozoruhodný úspěch. Vzhledem k tomu, že se jednalo o autotransplantace, nebyly nutné žádné imunosupresivní léky, ale jaterní buňky byly získány z velkých otevřených chirurgických biopsií. Tato nutnost chirurgického odběru jaterní tkáně by omezovala její použitelnost, nicméně byla dobrým důkazem konceptu studie. V souvislosti s autoimunitním diabetem může riziko recidivy onemocnění přetrvávat, pokud se nepodaří definovat a eliminovat cíl autoimunitního útoku. V těchto prasečích pokusech byl použit lidský inzulinový gen s promotorem EGR-1, který vnímá glukózu. Nebyl zapojen žádný virus a plazmid se neintegruje. Dělení transfekované buňky by oslabilo aktivitu genu, ale velké množství plazmidu lze vyrobit levně. Stejná skupina pracovníků úspěšně transfekovala mezenchymální kmenové buňky kostní dřeně plazmidem lidského inzulinového genu za použití stejného promotoru EGR-1 a elektroforace. Tím vyléčili diabetické myši po přímé intrahepatální a intraperitoneální injekci.

Nakonec je třeba být opatrný při interpretaci výsledků těchto a dalších zpráv o buněčné a genové terapii diabetu. In gene transfection and/or transplantation of insulin-producing cells or clusters in the diabetic rodent, there have been many reports in the literature, but only a few of these claims have been reproduced in independent laboratories. We have suggested the need to satisfy „The Seven Pillars of Credibility“ as essential criteria in the evaluation of claims of success in the use of stem cell and/or gene therapy for diabetes.

1. Cure of hyperglycemia

2. Response to glucose tolerance test

3. Evidence of appropriate C-peptide secretion

4. Weight gain

5. Prompt return of diabetes when the transfecting gene and/or insulin producing cells are removed

6. No islet regeneration of stereptozotocin-treated animals and no re-generation of pancreas in pancreatectomized animals

7. Presence of insulin storage granules in the treated cells