PMC

JINÉ SLTEKY NEŽ O157 : H7 V ČÍNĚ

E. coli O157 : H7 nebyla dosud v Číně považována za velký zdravotnický problém. STEC se však jeví jako závažná. V klinických nebo veřejně zdravotnických bakteriologických laboratořích se dříve diagnostikovaly sérotypizačními technikami pouze EPEC, ETEC a EIEC. Přesto bylo nezřídka zaznamenáno, že byly pozorovány téměř čisté kultury E. coli a z některých vzorků stolice průjmových pacientů byly izolovány nové odrůdy E. coli, které nebylo možné s dostupnými typery sérotypizovat . Otázkou stále zůstává, zda by měly být uznány jako patogenní E. coli, či nikoliv. Předpokládali jsme, že některé z těchto kmenů izolovaných jako E. coli mohou být patogenní povahy, které byly přehlédnuty z důvodu chybějících vhodných technik pro identifikaci. Abychom tuto hypotézu ověřili, shromáždili jsme v letech 1988-1990 v Pekingu 174 pojmenovaných nepatogenních kmenů E. coli a detekovali je pomocí sond DNA. Sondy DNA pokrývaly téměř všechny uváděné geny virulence, jako jsou heat-stable toxin (ST) heat-labile toxin (LT), EPEC adherence factor (EAF), diffuse adherence gene (DA), EHEC specifická sonda pCVD419, EAggEC specifická sonda, 2.5 Kb specifická sonda pro invazivní plazmid (INV) EIEC a Shigella-species, shig a-like toxin 1 nebo 2 (SLT1 nebo SLT2), EPEC attaching and effacing genes (eae). Bylo zjištěno, že 59,3 % testovaných kmenů hybridizovalo alespoň s jednou z použitých sond, přičemž vyšší procento (29,7 %) kmenů E. coli hybridizovalo se sondami SLT2 a INV.

Obecně kmeny EHEC a některé kmeny EPEC hybridizují se sondou SLT1 nebo/i SLT2. Sonda INV je 2,5-Kb fragment odvozený z invazivního plazmidu S.flexneri 2a a používá se jako diagnostický nástroj specifický pro druhy Shigella a kmeny EIEC. Fragment byl následně sekvenován a pojmenován invasive associated locus (ial). Nebylo však zjištěno, že by některý ze známých druhů EIEC nebo Shigella flexneri hybridizoval se sondami SLTs. Pro kl arifikaci vztahu mezi EIEC a některými námi izolovanými kmeny byl pomocí PCR syntetizován invazivní plazmidový antigen BCD (ipaBCD), klíčové geny pro invazivní schopnost EIEC a Shigella, označený digoxinem a použitý jako sonda. Absence hybridizačních signálů DNA naznačovala nedostatek genů ipaBCD v E. coli F171. Rovněž jsme zjistili, že E. coli F171 nemůže vyvolat keratokonjunktivitidu u morčat. Serenyho test byl použit jako kritický marker virulence druhů EIEC a Shigella. Pomocí HEp-2 buněčného testu je však E. coli F171 schopna invadovat epiteliální buňky. Tato data naznačují, že geny kódující invazivní schopnost E. coli-F171 se liší od EIEC, a E. coli F171 tedy není členem EIEC.

Adherence bakterií k epiteliálním buňkám byla uznána jako charakteristika virulence střevního patogenu. Byly definovány tři způsoby adherence, tj. lokalizovaná adherence, difúzní adherence a agregativní adherence. Mnoho našich kmenů E. coli hybridizovaných s DNA sondami SLT2 a INV vykazovalo vzor agregativní adherence k HEp-2 buňkám. Žádný z nich však nebyl hybridizován se specifickou sondou EAggEC, která byla odvozena z genů kódujících EAggEC adherenční faktor I (EAF/I) a použita jako identifikační marker pro EAggEC. Agregační vzorec adherence k buňkám HEp-2 je charakteristickým znakem kmenů EAggEC. Pod elektronovým mikroskopem byl na povrchu buněk E. coli F171 pozorován jedinečný druh fimbrie. Velikost podjednotky proteinu fimbrie byla 19KDa a geny kódující fimbrii byly umístěny na plazmidu o velikosti 60 MDa . Buňky E. coli HB101 obsahující klonované geny byly schopny adherovat na buňky HEp-2 . Analýza N terminální sekvence aminokyselin naznačila, že E. coli F171 má své jedinečné vlastnosti.

Toxiny podobné shiga byly prokázány jako faktory virulence kmene E. coli, který mohl způsobit HC a HUS. Mnoho kmenů EPEC a EHEC obsahuje geny pro SLT1 nebo SLT2. Schopnost E. coli F171 produkovat toxiny byla studována pomocí testu na buňkách Vero, který byl původně použit pro studium SLT, protože E. coli F171 byla hybridizována se sondou SLT2. Jak filtrát buněčné kultury, tak surový toxinový preparát E. coli F171 byly shledány toxickými pro buňky Vero. Toxicita E. coli F171 pro buňky Vero nemohla být neutralizována protilátkou SLT2. Skutečnost, že hybridizace E. coli F171 se sondou SLT2 naznačuje, že má fragment DNA homologní s genem SLT2 nebo má celý gen SLT2.

Invazivita, aktivita produkce toxinů a schopnost adherence k epiteliálním buňkám byly popsány jako klíčové vlastnosti pro EIEC, ETEC a EAggEC v tomto pořadí. E. coli F171 mohla adherovat na buňky HEp-2, invadovat do nich a produkovat toxiny. Kombinuje mnoho klíčových vlastností EIEC, EHEC, EPEC a EAggEC. Na základě získaných údajů se zdá, že E. coli F171 představuje novou odrůdu STEC. Proto byl navržen název enterická E. coli produkující SLT a invazivní E. coli (ESIEC). Vzhledem k tomu, že 31,4 % odebraných kmenů E. coli testovaných v našich studiích mělo podobné vlastnosti jako E. coli F171, zdá se, že infekce pravděpodobně způsobené tímto druhem patogenní E. coli představují v Číně významný problém veřejného zdraví.

Pro potvrzení virulence a patogeneze u člověka byla provedena studie u dospělých dobrovolníků. Při perorálním příjmu 109-1010 kolonie tvořících jednotek (CFU) E. coli F171 se u všech 8 dobrovolníků objevil průjem, u 3 z 8 se objevila vysoká horečka (39,8 °C). Inkubační doba se pohybovala od 7 do 49 h. Neformovaná stolice byla 3-6krát denně. Objemy stolice 4 dobrovolníků byly vyšší než 1000 ml denně. Antibiotickou léčbu podstoupilo 5 z 8 dobrovolníků. U kontrolní skupiny tvořené 4 dobrovolníky, kteří požili 109 CFU nepatogenního kmene E. coli-HB101, nebyl pozorován žádný průjem. Typickými klinickými příznaky pro ESIEC u dobrovolníků byly pohyb na míse, průjem, celková bolest břicha, mírná horečka a neforemná stolice. Bylo zjištěno, že požitá E. coli F171 může kolonizovat a replikovat se až 7 dní. Vyšetřením vzorků stolice dobrovolníků bylo zjištěno, že bakterie mohla dosáhnout množství 2,74 × 1012 CFU. Kmeny izolované ze vzorků stolice pacientů – dobrovolníků byly potvrzeny jako E. coli F171 pomocí specifického antiséra u zvířat proti ní.

Ačkoli byla rozpoznána lidská patogenita E. coli F171, klíčové faktory virulence ESIEC nebyly podrobně studovány. Nebyl například objasněn mechanismus patogenního působení ESIEC. „Ostrov patogenity“, který označuje velký chromozomální segment nesoucí geny podílející se na patogenitě, v nedávné době způsobil převrat v našem chápání bakteriální patogeneze. Obsah GC v ostrovech patogenity se liší od obsahu GC v ostatních hostitelských chromozomech, což naznačuje, že mohou vznikat horizontálním přenosem mezi různými obecnými bakteriemi. Počet gramnegativních bakteriálních druhů, o nichž je známo, že nesou ostrovy patogenity, neustále roste, včetně uropatogenních E. coli (UPEC), EHEC, EPEC, Helicobacter pylori, salmonella typhimurium a Vibrio cholerae. Předpokládá se, že u nepatogenních E. coli neexistuje žádný ostrov patogenity. Musíme prozkoumat ostrov patogenity, abychom potvrdili lékařský význam ESIEC. Nedávno jsme u mnoha kmenů ESIEC pozorovali gen irp2. Gen irp2 se podílí na příjmu železa a byl považován za jeden z genů virulence nacházejících se na ostrově vysoké patogenity (HPI) druhů rodu Yersinia. Tento gen byl pozorován u mnoha kmenů adherentních E. coli a u E. coli izolovaných z krve, ale zřídka byl pozorován u EPEC, EIEC nebo ETEC. No-irp2-byl nalezen u kmenů EHEC, Shigella a Salmonella enterica. Zdá se, že ostrov patogenity existoval u ESIEC. HPI Y. pestis se šíří mezi druhy čeledi Enterobacteriaceae, které jsou patogenní pro člověka.