Stanovení mutace V617F genu JAK2 u chronických myeloproliferativních syndromů u nás: kazuistika
Stanovení mutace V617F genu JAK2 u chronických myeloproliferativních syndromů u nás: kazuistika
Docenti Daniela Lens*, Pablo Muxi†, Lics. Andreína Brugnini‡,
Natalia Trías‡, Dra. Silvia Pierri§
Hospital de Clínicas. Lékařská fakulta.
Univerzita republiky. Montevideo, Uruguay
Abstrakt
Polycytemie vera (PV), esenciální trombocytemie (ET) a idiopatická myelofibróza (IM) jsou úzce související klonální myeloproliferativní onemocnění charakterizovaná nadměrnou proliferací jedné nebo více myeloidních linií, jako jsou erytrocyty, trombocyty a fibroblasty v kostní dřeni.
Přestože existují přísná kritéria pro diagnózu těchto myeloproliferativních syndromů, jejich přesná kategorizace zůstává předmětem diskusí a navíc je v mnoha případech obtížné tyto poruchy odlišit od reaktivních procesů.
Nedávno, v roce 2005, byla u několika z těchto jednotek identifikována mutace v genu pro tyrozinkinázu Janusova kináza 2 (JAK2). Tato mutace zahrnuje záměnu G za T na pozici 1849, což vede k záměně fenylalaninu za valin v proteinu (JAK2 V617F).
Výskyt této mutace byl pozorován přibližně u 90 % případů s PV a přibližně u 50 % případů s IM a ET.
V tomto článku popíšeme detekci této mutace u pacienta s diagnózou pravděpodobné PV pomocí vysoce citlivého testu alelově specifické polymerázové řetězové reakce (PCR) pro detekci této mutace a diskutujeme význam této nedávno objevené mutace v diagnostice a léčbě BCR-ABL-negativních myeloproliferativních syndromů.
Klíčová slova: MYELOPROLIFERATIVNÍ PORUCHY – diagnostika.
MUTACE – genetika.
PROTEIN-TYROSINOVÁ KINÁZA.
* Doc. Základní oddělení medicíny.
† docent. Hematologická klinika.
‡ Biochemie Lic. Asistent.
§ docent. Hematologická klinika. Klinické lékařské oddělení.
Korespondence: Dr. Daniela Lens.
Oddělení. Základní medicína. Hospital de Clínicas. Piso 15. Avda Italia s/n. Montevideo CP 11600. Montevideo, Uruguay.
Email: [email protected]
Přijato: 31/7/06.
Přijato: 26/2/07.
Úvod
Na rozdíl od chronické myeloidní leukemie, kde identifikace specifické přestavby BCR-ABL vedla k průlomu v diagnostice, sledování a léčbě této jednotky, u BCR-ABL negativních chronických myeloproliferativních syndromů (PMS), jako je polycytemia vera (PV), esenciální trombocytemie (ET) a idiopatická myelofibróza (IM), nebyly donedávna známy žádné specifické genetické změny.
Mezi květnem a červnem 2005 popsalo pět skupin vědců novou bodovou mutaci v genu pro tyrozinkinázu JAK2, způsobenou záměnou guaninu za thymin na nukleotidu 1849 v exonu 14, což má za následek záměnu valinu za fenylalanin na pozici 617 proteinu, pro kterou se mutace JAK2 nazývá V617F(1-5).
Tato mutace byla při použití vysoce citlivých testů k její detekci zjištěna přibližně u 90 % případů s PV(6). Byla také nalezena přibližně u 50 % případů s IM a ET, zatímco u zdravých osob ani u pacientů se sekundární erytrocytózou nalezena nebyla, takže tato mutace má velmi vysokou prediktivní hodnotu pro odlišení SMPC od neklonálních stavů, jako je sekundární polycytemie.
Tato mutace se vyskytuje ve vysoce konzervované oblasti autoinhibiční domény, která negativně reguluje signalizaci JAK2. Několik studií prokázalo, že se tato mutace podílí na patogenezi těchto stavů, zejména v důsledku zisku funkce genu JAK2 a prostřednictvím ztráty kontroly, které jsou spojeny s nadměrnou myeloproliferací těchto poruch.
V tomto článku popíšeme detekci této mutace u pacienta s diagnózou pravděpodobné PV a diskutujeme význam této nové mutace v diagnostice a léčbě BCR-ABL negativních SMP.
Materiál a metoda
Extrakce deoxyribonukleové kyseliny
Extrakce genomové deoxyribonukleové kyseliny (DNA) byla provedena z 1 ml citrované periferní krve pomocí komerčního činidla dnazol (Life Techno-logies) a podle protokolu uvedeného výrobcem. Vzorky DNA byly uchovávány při teplotě 4 °C.
Detekce mutace Vl617F
Mutace V617F byla detekována z dříve získané genomové DNA pomocí alelově specifické polymerázové řetězové reakce (PCR) podle metody publikované Baxterem et al(1). Tato PCR je navržena pro použití tří různých primerů nazvaných JAK2R, JAK2F/IC a JAK2F (tabulka 1). Primer JAK2F je specifický pro mutantní alelu a primer JAK2F/IC se nachází u všech jedinců bez ohledu na přítomnost či nepřítomnost mutace, a představuje tak vnitřní kontrolu reakce. U všech jedinců je tedy pomocí primerů JAK2F/IC a JAK2R amplifikován produkt o velikosti 364 párů bází (bp) a pouze u jedinců se studovanou mutací je pomocí primerů JAK2F a JAK2R získán produkt o velikosti 203 bp (obrázek 1).
PCR amplifikace byla provedena v konečném objemu 20 uL s použitím 500 ng DNA, 200 mM/L jednotlivých dNTP, 0,5 U Taq polymerázy (New England Biolabs) a 2 uL 10x Taq pufru obsahujícího 2 mM MgCl (New England Biolabs), 0,5 mM primerů JAK2 F a JAK2 F/IC a 1 mM primeru JAK2 R.
Použitý program PCR se skládá z 36 cyklů, které začínají 5minutovou denaturací, následuje cyklování: 30 sekund při 94 °C, 30 sekund při 58 °C a 30 sekund při 72 °C, zakončené závěrečnou 5minutovou extenzí. Do všech reakcí byla vždy zahrnuta negativní kontrola obsahující všechna činidla nezbytná pro amplifikaci, v níž je templát DNA nahrazen vodou. Ověření očekávaného produktu PCR bylo provedeno na 2% agarózovém gelu obarveném ethidium bromidem(7).
Analýza případu
Pacient, 72 let, silný kuřák, s léčenou chronickou arteriální hypertenzí a nositel chronické obstrukční arteriopatie, kterému byla v roce 2002 stanovena amputace 5. prstu levé nohy. V prosinci 2004 se u něj objevila nová obstrukční příhoda na levé dolní končetině a hemogram ukázal zvýšení počtu červených krvinek s hematokritem 66 %, spolu s granulocytózou 24 000 a trombocyty 245 000. Hematokrit zůstal stejný a počet krevních destiček se postupně zvýšil na 710 000. V bioptickém vyšetření kostní dřeně byla pozorována hypercelulární kostní dřeň s hyperplazií erytroidní řady, což vedlo k závěru o chronickém myeloproliferativním syndromu typu PV.
Pacientka byla léčena flebotomií a v květnu 2005 zahájila léčbu hydroxyureou, která byla v únoru 2006 ukončena z důvodu krvácivé komplikace.
Jak je znázorněno na obrázku 2, pacientka vykazovala při vyšetření alelově specifické PCR pro mutaci V617F genu JAK2 vzorec se dvěma pásy. Na jedné straně kontrolní pás o velikosti 364 bp, který je přítomen i u dvou studovaných zdravých kontrol. Na druhé straně byl u pacienta amplifikován také produkt o velikosti 203 bp, který prokazoval přítomnost mutace. Tento pás nebyl pozorován u zdravých kontrol.
Diskuse a závěry
V této práci jsme popsali první případ, kdy byla u nás identifikována mutace V617 genu JAK2. Tato práce je součástí multidisciplinárního projektu Základní lékařské kliniky a hematologického oddělení Hospital de Clínicas, jehož cílem je zjistit přítomnost této mutace u 100 pacientů s BCR-ABL-negativním PMS.
Nedávná identifikace aktivační mutace V617F v genu JAK2 představuje významný pokrok v poznání patogeneze BCR-ABL-negativních myeloproliferativních syndromů. Vzhledem k vysoké frekvenci výskytu této mutace u PV a v menší míře u ET a IM se předpokládalo, že odhalení této mutace bude mít velký vliv na diagnostiku, klasifikaci a léčbu těchto jednotek. Různé skupiny navrhly zařadit detekci této mutace jako diagnostický test první volby při hematokritu vyšším než 51 % nebo při podezření na PV, protože detekce JAK2 V617F má 100% pozitivní prediktivní hodnotu pro diagnózu PV(8,9). Na druhou stranu někteří autoři postulovali, že přítomnost této mutace by umožnila novou klasifikaci PMS, protože ET, PV a MI nesoucí mutaci JAK2 by mohly představovat stejné onemocnění v různých vývojových stadiích, nikoliv různé jednotky(10-12). Přesný klinický význam a přínos detekce této mutace však zatím nebyl stanoven a k vyřešení těchto otázek je třeba speciálně navržených prospektivních klinických studií.
Objev této mutace navíc otevírá nové možnosti pro léčbu specificky zaměřenou na mutovanou proteinkinázu, podobně jako je tomu u inhibitorů BCR-ABL u chronických myeloidních leukemií.
Shrnutí
Polycytemia vera (PV), esenciální trombocytemie (ET-TE) a idiopatická myelofibróza (IM-MI) jsou klonální myeloproliferativní onemocnění charakterizovaná nadměrnou proliferací jedné nebo více myeloidních linií, jako jsou erytrocyty, trombocyty a fibroblasty kostní dřeně.
Přesná kategorizace myeloproliferativních syndromů je stále předmětem diskusí, i když diagnostická kritéria jsou přísná; navíc je obtížné tyto poruchy odlišit od reaktivních procesů.
Nedávno, v roce 2005, byla u mnoha z těchto jednotek identifikována JAK2-mutace. Sekvenování kódující oblasti JAK2 odhalilo transverzi G na T na pozici 1849, která změnila valin na fenylalanin (JAK2 V617F).
Incidence mutace V617F-JAK2 byla téměř 90 % u pacientů s PV a 50 % u pacientů s IM a ET.
V této studii popisujeme detekci mutace V617F-JAK2 u pacienta s podezřením na PV pomocí alelově specifické analýzy polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) a diskutujeme význam této mutace pro diagnostiku a léčbu negativních myeloproliferativních syndromů BCR-ABL.
Résumé
Polycytémie vera (PV), esenciální trombocytemie (ET) a idiopatická myelofibróza (IM) jsou úzce související klonální myeloproliferativní onemocnění charakterizovaná nadměrnou proliferací jedné nebo více myeloidních linií, jako jsou erytrocyty, trombocyty a fibroblasty kostní dřeně.
Přestože existují přísná kritéria pro diagnózu těchto myeloproliferativních syndromů, jejich přesná kategorizace zůstává předmětem diskusí, a navíc je v řadě případů obtížné odlišit tyto poruchy od reaktivních procesů.
Nedávno, v roce 2005, byla u několika z nich identifikována mutace v tyrozinkinázovém genu Janusovy kinázy 2 (JAK2). Tato mutace spočívá v záměně G za T v pozici 1849, což vede k záměně fenylalaninu za valin v proteinu (JAK2 V617F).
Výskyt této mutace byl pozorován u téměř 90 % případů s PV a přibližně u 50 % případů s MI a TE.
V této práci popíšeme detekci této mutace u pacienta s diagnózou pravděpodobné PV pomocí alelově specifické polymerázové řetězové reakce (PCR) s vysokou citlivostí pro detekci této mutace a budeme diskutovat význam této nově objevené mutace v diagnostice a léčbě BCR-.ABL negativní myeloproliferativní syndromy.
Resumo
A Policitemia Vera (PV), a trombocitemia hemorrágica (TE) e a mielofibrose idiopática (MI) são transtornos mieloproliferativos clonais fortemente relacionados e caracterizados por uma proliferação excessiva de uma ou mais línhas mielóides tais como eritrócitos, platequetas e fibroblastos da medula óssea.
Embora existam critérios rigorosos para o diagnóstico destas síndromes mieloproliferativas, a classificação precisa continua sendo discutida; ademais muitas vezes é muito difícil diferenciar estes distúrbios de processos reativos.
V roce 2005 byla u několika z nich identifikována mutace v genu pro tyrozinkinázu Janusova kináza 2 (JAK2). U této mutace dochází k záměně G za T na pozici 1849, což vede k záměně fenylalaninu za valin (JAK2 V617F) v proteinu.
Tato mutace byla pozorována přibližně u 90 % případů s PV a přibližně u 50 % případů s MI a TE.
V tomto článku popisujeme detekci této mutace u pacienta s pravděpodobnou diagnózou PV pomocí vysoce citlivého testu alelově specifické polymerázové řetězové reakce (PCR) pro detekci této mutace a diskutujeme význam této nově objevené mutace v diagnostice a léčbě BCR-ABL-negativních myeloproliferativních syndromů.
Bibliografie
1. Baxter EJ, Scott LM, Campbell PJ, East C, Fourouclas N, Swanton S, et al. Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders. Lancet 2005; 365: 1054-61.
2. James C, Ugo V, Le Couedic JP, Staerk J, Delhommeau F, Layout C, et al. Unikátní klonální mutace JAK2 vedoucí ke konstitutivní signalizaci způsobuje polycythaemia vera. Nature 2005; 434: 1144-8.
3. Kralovics R, Passamonti F, Buser AS, Teo SS, Tiedt R, Passweg JR, et al. Mutace typu gain of function v JAK2 se často vyskytuje u pacientů s myeloproliferativními poruchami. N Engl J Med 2005; 352: 1779-90.
4. Levine RL, Waldleigh M, Cools J, Ebert BL, Werning G, Huntly BJ, et al. Activating mutation in the tyrosine kinase JAK2 in polycythaemia vera, essential thrombocythemia, and myeloid metaplasia with myelofibrosis. Cancer Cell 2005; 7: 387-97.
6. Vainshenker W, Constantinescu SN. Unikátní aktivační mutace v JAK2 (V617F) stojí na počátku Polycythemia Vera a umožňuje novou klasifikaci myeloproliferativních onemocnění. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2005; 195-200.
7. Sambrook J, Russell DW. Molekulární klonování: laboratorní příručka. Vyd. 3. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 2001.
8. Tefferi A, Pardanani A. Screening mutací JAK2V617F: kdy test objednat a jak interpretovat výsledky. Leuk Res 2006; 30(6): 739-44.
9. James C, Delhommeau F, Marzac C, Teyssandier I, Couedic JP, Giraudier S, et al. Detekce JAK2 V617F jako diagnostický test prvního záměru u erytrocytózy. Leukemia 2006; 20: 350-3.
10. Campbell PJ, Scott LM, Buck G, Wheatley K, East CL, Marsden JT, et al. Definice podtypů esenciální trombocytemie a vztah k polycythaemia vera na základě stavu mutace JAK2 V617F: prospektivní studie. Lancet 2005; 366: 1945-53.
11. Antonioli E, Guglielmelli P, Pancrazzi A, Bogani C, Verrucci M, Ponziani V, et al. Clinical implications of JAK2 V617F mutation in essential thrombocythemia. Leukemia 2005; 19: 1847-9.