A vázizom tömegének és erejének hosszú távú növelése myosztatin-inhibitorok egyszeri génadagolásával

Eredmények és vita

AzAAV által közvetített génszállítás az izomba olyan rendszert biztosít, amely nagy mennyiségű fehérjét hoz létre a célszövetben vagy a keringésen keresztül távoli helyekre szállított szekretált termékkel (19). Az AAV 1-es szerotípusba klónoztuk az ismert szekretált miosztatin-gátló géneket, köztük a növekedési és differenciálódási faktorral asszociált szérumfehérje-1-et (GASP-1) (18), a follistatinnal kapcsolatos gént (FLRG) (17) és a follistatin-344-et (FS) (13) (13), amelyek magas izomtranszdukciós képességet mutattak. A follistatinnak két izoformája létezik, amelyek alternatív splicing révén keletkeznek. Az FS-344 variáns peptidhasításon megy keresztül az FS-315 izoforma létrehozásához, a másik FS-317 variáns pedig az FS-288 izoformát hozza létre peptidhasítás után. Mi a humán FS-344 variánst használtuk, amely kizárólag az FS szérumban keringő FS-315 izoformáját hozza létre, és tartalmaz egy C-terminális savas régiót (20). Azért választottuk az FS-344 (FS) változatot, mert a másik FS-317 izoforma, amelyből hiányzik a C-terminus, preferenciális lokalizációt mutat a petefészek tüszőfolyadékában és magas szöveti kötődési affinitást a heparin-szulfát proteoglikánokon keresztül, ami befolyásolhatja a reprodukciós képességet és más off-célpontokhoz is kötődhet (21). Az FS-288 a follistatin membránhoz kötött formáját képviseli (22), az agyalapi mirigy tüszőstimuláló hormon erős szuppresszora (23), megtalálható a petefészek tüszőfolyadékában és a herékben, és nagy affinitást mutat a petefészek granulózasejtjei iránt.

Ezeknek a fehérjéknek a hatékonyságát próbáltuk meghatározni az izomtömeg növelésére normál és dystrophiás egerekben. Állatonként 1 × 1011 FS-t, FLRG-t, GASP-1-et vagy GFP-t kódoló AAV1 vírusrészecskét adtunk be kétoldalt 4 hetes vad típusú C57BL/6 egerek quadriceps és tibialis anterior izmaiba. A miosztatin-inhibitorokkal kezelt összes állat testtömeg-növekedést mutatott, az izmok megfigyelhető durva növekedésével, amikor 725 napos korban elemezték őket a GFP-vel kezelt kontrollokhoz képest (1. a és b ábra). Az egyes izmok tömegének értékelése az izomtömeg növekedését mutatta az összes mikosztatin-inhibitorral kezelt állat esetében, a legnagyobb növekedést az FS-kezelt állatoknál. A megnövekedett izomtömeg az injektált hátsó végtag izmaiban és az injekció beadásának helyétől távoli izmokban, például a tricepszben volt kimutatható. Így ezek az inhibitorok az izombefecskendezés helyéről szekretálódtak a keringésbe, növelve a vázizomtömeget a távoli helyeken (1. ábra c). A megnövekedett izomtömeget funkcionális javulás kísérte, amit a hátsó végtagok fogóerejének növekedése mutatott (1. ábra d). A szív tömegére vagy a kardiomiociták szövettani megjelenésére nem volt hatás, ami azt jelzi, hogy a miosztatin gátlása szelektív volt a vázizomszövetre (adatok nem láthatóak). Felmerült az az aggodalom, hogy az FS hátrányosan befolyásolja a gonádok működését. Nem találtunk változást a reprodukciós képességben az FS344 transzgént hordozó AAV1-ünkkel kezelt egerekben (AAV1-FS, 1. táblázat) Továbbá nem találtunk szövettani/patológiai elváltozásokat az FS kezelt egerek gonádszövetében a kontrollhoz képest (az adatok nem láthatóak).

Az FS beadásának robusztus hatásai miatt a következőkben azt vizsgáltuk, hogy a posztnatálisan beadott AAV1-FS klinikailag értelmezhető paradigmában növelheti az izomtömeget és -erőt, és késleltetheti az izomromlást a Duchenne-izomdisztrófia (DMD) mdx egérmodelljében. A DMD egy X-kromoszómával összefüggő recesszív betegség, amely a vázizomzat és a szívműködés elsorvadását eredményezi, és végül halálhoz vezet. Nemrégiben FS-t vizsgáltak a follistatin gén duplikált doménjét overexpresszáló mdx állatokban. Az eredmények megnövekedett izomtömeget és csillapított patológiát mutattak, bár az eredményeket csak 15 hetes korig dokumentálták (24). Vizsgálatainkban az mdx állatokat 3 hetes korukban kétoldalt a quadriceps és a tibialis anterior izmokba injektálták az AAV1-FS alacsony (1 × 1010 vírusrészecske) vagy magas dózisával (1 × 1011 vírusrészecske), majd 5 hónapig követték őket a boncolás előtt. A keringő FS megnövekedett szintjét mutatták ki mind az alacsony, mind a magas dózissal kezelt állatok szérumában, a magas dózis esetében volt a legnagyobb a szérumban kimutatott FS szintje (magas dózis, 15,3 ± 2,1 ng/ml; alacsony dózis, 6,8 ± 0,4 ng/ml; GFP kontrollok, 0 ± 0,1 ng/ml; n = 8 csoportonként; P < 0,01). Kimutattuk, hogy az AAV1-FS növelte a testtömeget a GFP-vel kezelt kontrollokhoz képest, a legnagyobb növekedést a nagy dózisú FS csoportban (az adatok nem láthatóak). Az AAV1-FS-sel kezelt egerek durva megfigyelése az AAV1-GFP-vel kezelt állatokhoz képest szignifikáns izomnagyobbodást mutatott (2. a ábra), a legnagyobb egyéni izomtömeg-növekedéssel a nagy dózisú FS-sel kezelt állatokban (2. b ábra). A hatások nem korlátozódtak az injektált izmokra; a közvetlenül célzott izmoktól távoli helyeken is megfigyelhetőek voltak (2. b ábra). A megnövekedett izomtömeg az izomerő dózisfüggő javulásához vezetett a kezelt állatok hátsó és mellső végtagjaiban a GFP-vel kezelt kontrollokhoz képest (2. ábra c). Az AAV1-FS injektált izmok és a távoli helyeken végzett szövettani és morfometriai elemzések myofiber hipertrófiát mutattak, ami alátámasztja a boncoláskor tett durva megfigyeléseket (3. ábra a-c). Továbbá az AAV-FS-sel kezelt állatokban nem volt változás az izomrosttípusokban; azonban a tibialis anterior izomban kevesebb volt az összes rost négyzetmilliméterenként a nagy dózisú AAV-FS-sel kezelt állatokban (3. ábra d és e). Feltűnő, hogy az FS-kezelt egerek szignifikánsan csökkentették a szérum kreatin-kináz szintjét a GFP-vel kezelt kontrollokhoz képest (4. ábra a). Ez azért érdekes, mert az FS védő hatású volt annak ellenére, hogy nem korrigálta az alapjául szolgáló dystrophinhiányt. A pontos mechanizmus nem világos, de feltételezhető, hogy az egyes rostok erősségének növelése kevésbé teszi őket érzékennyé a normál tevékenységek stresszéből eredő károsodásra. A szatellit sejtek részvétele a posztnatális myostatin gátlásban még nem teljesen tisztázott; azonban nem tapasztaltunk statisztikai változást az izom szatellit sejt markerekben az FS kezelt állatok esetében (az adatok nem láthatóak).

Megvizsgáltuk azt is, hogy az AAV1-FS növelheti-e az mdx állatok izomerejét, ha idősebb korban kezelik. Azt találtuk, hogy az AAV1-FS beadása 210 napos korban növelte az izomerő ≈60 nappal a beadást követően, és a megnövekedett erő hosszú távon fennmaradt az ebben a vizsgálatban vizsgált 560 nap alatt (4. ábra b). Már 180 napos korban, az AAV1-FS-kezelés előtt, a kezeletlen mdx állatok izmaiban nyilvánvaló patológia mutatkozott, markáns endomysialis kötőszöveti proliferációval és gyulladással (4. ábra c és d). A gastrocnemius és a rekeszizom patológiai értékelése 560 napos korban azt mutatta, hogy az AAV1-FS-sel kezelt állatokban lényegesen kevesebb volt a nekrotikus izomrostok gócos csoportja és a mononukleáris sejtek infiltrációja. Fontos, hogy az AAV1-FS-sel kezelt állatokban jelentősen csökkent az endomysialis kötőszöveti proliferáció gócos területei, amelyek a GFP-vel kezelt állatokban kifejezettek voltak, ami azt mutatja, hogy az FS-sel kezelt állatokban csökkent a fibrózis, az izomdisztrófia egyik jellemzője (4. ábra c). A rekeszizom patológiája szintén azt mutatta, hogy az FS-kezelés csökkentette a gyulladást és a zsírpótlást a GFP-vel kezelt állatokhoz képest (4. ábra d). Továbbá az AAV1-FS kezelés ebben a korban az izomrostok átmérőjének jelentős növekedését mutatta a kontroll GFP-vel kezelt állatokhoz képest (4. ábra c és d). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a miosztatin gátlása FS kezeléssel előnyös volt az idős mdx állatokban, amelyek többszörös izomdegeneráción és regeneráción estek át. A klinikai párhuzamra való átültetés azt sugallja, hogy az AAV-mediált FS-génterápia potenciálisan alkalmazható az idősebb DMD-s betegeknél, függetlenül a hiányzó gén pótlásától, és potenciális szerepe lehet a kombinált terápiában, hasonlóan az IGF-1 és minidisztrofin génpótlás esetében kimutatotthoz (25).

Az eredmények arra utalnak, hogy a miosztatin FS-344 általi gátlása egyetlen AAV1 injekcióval növelheti az izom méretét és erejét, és >2 éven keresztül jól tolerálható. Az FS344 eredményei erőteljesebb stratégiát kínálhatnak, mint más, kizárólag a miosztatint célzó készítmények, mivel az additív hatások, például a folisztatin több jelátviteli útvonalban való részvétele, valamint az endotoxémia modelljében a gyulladás csökkenését bizonyító közelmúltbeli eredmény miatt (15, 26). Az FS feltűnő képessége, hogy idős állatokban a dystrophiás izmok hosszú távú bruttó és funkcionális javulását biztosítja, indokolja a klinikai fejlesztés megfontolását a mozgásszervi betegségek kezelésére, beleértve az idős DMD-s betegeket is.