Role of Candida in Antibiotic-Associated Diarrhea

Abstract

A Candida fajok antibiotikum-asszociált hasmenésben (AAD) betöltött szerepének kvantitatív értékeléséhez összesen 395 beteg és kontrollszemély székletmintáját tenyésztették differenciális izolációs táptalajon: 98 betegnek volt AAD-ja, 93 beteg antibiotikumot szedett, de nem volt hasmenése (A+D-), 97 beteg nem szedett antibiotikumot, de hasmenése volt (A-D+), és 107 beteg volt kontrollszemély (A-D-). Ezenkívül vizsgálták a szekretált aszpartilproteináz (Sap) termelését is. Az AAD betegeknél a Candida-pozitivitás (77/98) és a Candida túlszaporodása (62/98) nem különbözött az A+D- betegekétől (75/93 és 52/93 , illetve). Az A-D+ betegek körében a Candida túlszaporodása (40/97, P=,003) ritkább volt, mint az AAD betegek körében, de a Candida-pozitivitás nem különbözött (80/97, P=,612). A kontrollszemélyeknél a Candida-pozitivitás és a túlszaporodás ritkább volt, mint az összes többi csoportban. A Sap termelése nem különbözött az AAD-betegek és a kontrollszemélyek között (P=,568 és P=,590). Az adatok arra utalnak, hogy az emelkedett Candida-szám inkább az antibiotikum-kezelés vagy a hasmenés következménye, mint az AAD oka

A Candida-fertőzések leggyakoribb patológiai manifesztációja a szájpenész és a nyelőcsőgyulladás . A Candida szerepe az antibiotikumokkal összefüggő hasmenésben (AAD) vitatott . A Candida fajok ⩾105 cfu/ml széklet-koncentrációja a székletben antibiotikum-terápiát követő hasmenés okozójának tekinthető. Arról számoltak be, hogy az antibiotikumot kapott betegeknél hasmenés kialakulása nélkül <105 cfu Candida gombák/mL széklet

A szekretált aszpartil proteinázok (Saps) a Candida fajok által termelt fontos virulenciafaktorok. A sapsok részt vesznek a Candida albicans emberi nyálkahártyához való tapadásában és az emberi szövetek inváziójában. A Saps expressziója és a Candida virulenciája között összefüggést mutattak ki a humán immunhiányos vírus (HIV) fertőzött betegek orális candidiasisában és Candida vaginitisében . A Candida okozta AAD-ban a hasmenés patogenetikai mechanizmusaként a gombatoxin vagy toxinszerű anyagok által közvetített aktív szekréciót vitatták . A C. albicansben 10 különböző SAP gént azonosítottak . A Candida tropicalisban gyenge extracelluláris proteolitikus aktivitást figyeltek meg , míg a Candida glabrata nem mutat proteolitikus aktivitást fehérje agaron

A C. albicansról ismert, hogy aszpartil proteinázokat termel, ha fehérjét mint egyedüli nitrogénforrást tartalmazó közegben termesztik , és az SAP2 gén expressziója felelős elsősorban az in vitro élesztő formában növekvő legtöbb törzsben megfigyelt proteolitikus aktivitásért . A sapok a gasztrointesztinális traktusban is mutatnak proteolitikus aktivitást; kimutatták a SAP expresszióját orális candidiasisban és a gasztrointesztinális mucin sapok általi lebontását . A gasztrointesztinális mucin enzimek általi lebontása számos enteropatogén (pl. Vibrio cholerae, Shigella fajok, Helicobacter pylori és Yersinia enterocolitica) virulenciát meghatározó tényezője . A nyálkahártya-felületeket kolonizáló C. albicans esetében a SAP2 általi mucinlebontás lehetővé teheti a hámsejtekhez való szorosabb közeledést és/vagy a sejtfelületek módosítását . Az akut és krónikus hasmenésben szenvedő gyermekeknél a szekretoros Candida savas proteináz magasabb szintjét találtuk, mint az egészséges kontrollszemélyeknél

A Candida fajok patogenetikai jelentőségének tisztázása érdekében 395 immunkompetens felnőtt betegnél végeztünk kvantitatív széklettenyésztést Candida fajok kimutatására. Emellett megvizsgáltuk a szappanok termelődését

Módszerek

Páciensek kiválasztása és székletminták gyűjtéseEgy 250 ágyas orvosi osztályon 11 hónapon keresztül minden beteget naponta vizsgáltunk hasmenés vagy hasmenés hiányában antibiotikumos kezelés miatt. A hasmenést >3 pépes vagy vizes székletként definiálták naponta . Az antibiotikum-kezelést úgy definiálták, hogy szájon át vagy intravénásan kaptak antibiotikumot terápiás dózisban ⩾1 napon keresztül. Az AAD meghatározása: >3 pépes vagy vizes széklet naponta az antibiotikum-kezelés alatt vagy legfeljebb 2 hónappal azt követően . A betegeket egymás után vették fel 4 vizsgálati csoportba, amíg el nem érték a statisztikai összehasonlításhoz szükséges, előre meghatározott létszámot (lásd alább a statisztikai elemzést). A betegeket csak egyszer vették fel a kórházi felvételük során

A hasmenéses betegek székletmintáit szelektív agaron tenyésztették bakteriális kórokozókra (szalmonella, shigella, yersinia és campylobacter), megvizsgálták petesejtekre és parazitákra, valamint szelektív agaron tenyésztéssel és a C. difficile gyorsteszt (BD) alkalmazásával Clostridium difficile-tesztet végeztek. Azokat a betegeket, akiknél e kórokozók bármelyike előfordult, kizárták a vizsgálatból. Így 395 beteg (195 hasmenéses és 200 hasmenés nélküli) került be a vizsgálatba, akiket 4 csoportba soroltak: (1) A+D+ csoport, 98 antibiotikumot kapó és hasmenést tapasztaló AAD-beteg; (2) A+D- csoport, 93 antibiotikumot kapó, de hasmenést nem tapasztaló beteg; (3) A-D+ csoport, 97 antibiotikumot nem kapó, de hasmenést tapasztaló beteg; és (4) A-D- csoport, 107 antibiotikumot nem kapó és hasmenést nem tapasztaló kontrollszemély

A 4 csoport nem különbözött a nem és az életkori megoszlás tekintetében. Az összes alany székletmintáját közvetlenül székletürítés után vették, és 15 percen belül bevitték az ugyanabban az épületben lévő laboratóriumba. Az éjszaka folyamán ürített székletből származó mintákat 4°C-on tároltuk, és másnap reggel dolgoztuk fel őket

Kandida kultúrák és preparátumkenetekA székletmintákat 1:10 arányban sóoldattal hígítottuk, széklethomogenizátorban megkevertük, majd ismét 1:1000 és 1:10000 arányban sóoldattal hígítottuk. Mindegyik hígításból száz mikrolitert Candida CHROMagarra (BBL) vittünk át, és steril tamponnal egyenletesen lekentük. A 37 °C-on, környezeti levegőn történő 48 órás inkubáció után a Candida-telepeket megszámoltuk, és a telepek színe alapján C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis vagy egyéb Candida fajnak minősítettük. A ⩾105 cfu/mL székletkolóniát a Danna és munkatársai szerint “Candida-túlszaporodásnak” minősítették. Az első 100 egymást követő székletminta minden egyes hígításából készült preparátumkenetet Gram-festékkel festették meg, és fénymikroszkópos vizsgálattal vizsgálták az élesztőgombák és a leukociták jelenlétét

A szappanok kimutatásaAz A-D- és az A+D+ betegcsoportból származó Candida-izolátumokat aszpartilproteináz-szekréció szempontjából szarvasmarha-szérumalbumin (BSA) agaron (1,17% élesztő szénbázis , 0,01% élesztőkivonat és 0,2% BSA ) vizsgálták, a máshol leírtak szerint . A táptalajt pH 5,0-ra állítottuk be, szűréssel (pórusméret 0,2 μm) sterilizáltuk, és autoklávozott (2%-os) agar törzsoldatához adtuk. Az enzimaktivitást jelző proteolízist milliméterben mértük, és a máshol javasolt módon pontoztuk: – vagy ± (nem volt látható vagy csak nagyon korlátozott mértékben tisztult az agar a kolónia körül), 1+ (jelentős proteolízis volt megfigyelhető) és 2+ (az agar tisztulása nagymértékben meghaladta a kolónia szélét ). Kontrollként a C. albicans SC5314 törzset és egy SAP2 nullmutánst (B. Hube, Hamburgi Egyetem, Németország) vizsgáltunk

Statisztikai elemzésA különböző csoportokban a különböző Candida-számú betegek számát a χ2 teszt segítségével hasonlítottuk össze, és a preparátumkeneteken lévő élesztőgombák számát Pearson-féle korrelációval korreláltuk a tenyészetekből származó Candida-számmal. A Sap-termelésben mutatkozó különbségeket Student’s t és Fisher’s exact tesztek segítségével számoltuk ki. A mintanagyságot a tenyésztési teszthez 91 értékelhető betegben, a Sap-teszthez pedig csoportonként 20 értékelhető betegben számoltuk ki, 0,05-ös α és 0,8-as teljesítmény mellett (SigmaStat, 2.0 verzió; Jandel Scientific). A P<.05 értékű különbségeket szignifikánsnak tekintettük

Eredmények

Candida-kultúrák és preparátumkenetekA Candida-kultúrák eredményeit az 1. ábra mutatja. Az A+D+ csoportban a Candida-pozitivitás (77/98 betegnél) és a Candida-túltengés (62/98 betegnél) nem különbözött szignifikánsan az A+D- csoportban tapasztaltaktól (75/93 betegnél, illetve 52/93 betegnél ). Az A-D+ csoportban a Candida túlszaporodása szignifikánsan ritkább volt, mint az A+D+ csoportban (P=,003), de a Candida-pozitivitás nem különbözött szignifikánsan (P=,612). Az A-D- csoportban a Candida-pozitivitás és a Candida túlburjánzás szignifikánsan ritkább volt, mint az összes többi csoportban (Candida-pozitivitás: 66/107 beteg, P=.013, az A+D+ csoporthoz képest; P=.005, az A+D- csoporthoz képest; és P=.002, az A-D+ csoporthoz képest; Candida túlburjánzás: 15/107 beteg, P<.001, az összes többi csoporttal összehasonlítva; 1. ábra)

A Candida-túlszaporodás meghatározásához különböző határértékeket (103, 104, 106 vagy 107 cfu/mL széklet) alkalmazó exploratív elemzések minőségileg hasonló eredményeket hoztak. Minden számításban a Candida túlszaporodása szignifikánsan ritkább volt az A-D- csoportban, mint az összes többi csoportban. A C. albicans volt a leggyakoribb izolátum (395 betegből 216), amelyet a C. glabrata (395 betegből 104), a C. tropicalis (395 betegből 21), a C. krusei (395 betegből 11) és az egyéb Candida fajok (395 betegből 97) követtek. A 395 beteg közül 122-nél (31%) találtak vegyes Candida-kultúrát. Az élesztőgombák száma a preparátumkeneteken nem korrelált a tenyészeteken mért számokkal (r=.27; 2. ábra)

Proteolitikus aktivitás eredményei BSA-agaronA BSA-agaron összesen 23 A+D+ és 20 A-D-Candida izolátumot vizsgáltak proteolitikus aktivitás szempontjából. Az átlagos±SD aktivitás 1,26±1,06 mm volt az A+D+ csoportban és 1,42±0,64 mm az A-D- csoportban. A 23 A+D+ izolátum közül 16 proteolízis eredménye 1+ (1-2 mm-es tisztulási zóna), 1 pedig 2+ (3-5 mm-es tisztulási zóna) volt, mindkettő a proteináz enzimaktivitás jelenlétét jelezte. A 20 A-D- izolátum közül 17 proteolízis eredménye 1+, 2 pedig 2+ volt. Minden C. albicans izolátum BSA táptalajon tisztulási zónát mutatott (⩾1 mm, ⩾1+ pontszám). Az A-D- csoportban 1 C. tropicalis izolátum nem mutatott proteolízist. Az A+D+ csoportban 5 C. glabrata izolátum és 1 C. tropicalis izolátum nem mutatott proteolízist. Az A-D- és az A+D+ csoport tisztulási zónái nem különböztek szignifikánsan sem milliméterben (P=.568, Student’s t teszt), sem az 1+/2+ pontozási rendszerrel (P=.294 és P=.590 az 1+ és 2+ pontszámot kapott izolátumok esetében, Fisher pontos teszt) . Amikor a C. glabrata izolátumokat (amelyekről ismert, hogy fehérjeagaron negatívak) törölték, nem volt szignifikáns különbség a Sap-termelésben a csoportok között (P=.347)

Diszkusszió

Aandida túlszaporodás a feltételezések szerint AAD-t okoz . Vizsgáltuk a Candida fajok jelenlétét és mennyiségét AAD-gyanús betegeknél, hasmenés nélküli, de antibiotikumot szedő betegeknél, hasmenéses, de antibiotikumot nem szedő betegeknél, valamint hasmenés nélküli, antibiotikumot nem szedő betegeknél (kontrollszemélyek). Az antimikrobiális terápiában részesülő és hasmenéses betegek (A+D+ csoport) székletmintáinak szignifikánsan nagyobb hányada volt pozitív Candida fajokra és magasabb kolóniaszámmal rendelkezett, mint a kontrollszemélyek (A-D- csoport) mintái. A Danna és munkatársai által végzett vizsgálatban 24 AAD-beteg közül 7-ben (29%) mutattak ki Candida-túlszaporodást (⩾105 cfu/ml széklet). Ebben a vizsgálatban 24 hasmenés nélküli, de antibiotikumot kapó beteg közül 0-nál volt Candida-túlszaporodás . A mi vizsgálatunkban azonban 93 antibiotikumot kapó, de hasmenés nélküli beteg közül 52-nél (56%) volt Candida-túlszaporodás, és nem volt különbség az AAD-betegekhez képest. Mivel közel négyszer annyi beteget vizsgáltunk (93 vs. 24), a mi és Danna és munkatársai eredményei közötti különbség a mi vizsgálatunk nagyobb mintanagyságának tudható be

A hasmenésnek a bélrendszeri Candida-számra gyakorolt hatásának felmérése érdekében olyan betegeket is vizsgáltunk, akik nem kaptak antibiotikum-terápiát, de hasmenésük volt (A-D+ csoport). Ebben a csoportban a Candida-túlszaporodás (⩾105 cfu/ml széklet) szignifikánsan ritkább volt, mint az AAD-betegeknél, de a Candida-pozitivitás nem különbözött szignifikánsan. Korábbi vizsgálatok azt mutatták, hogy a normális székletflóra jelentősen csökkent az AAD-betegeknél. Azokban a vizsgálatokban, amelyekben a széles spektrumú antibiotikumok hatását vizsgálták az emberek bélflórájának összetételére, szignifikáns inverz korrelációt figyeltek meg az élesztők maximális növekedésének logaritmusa és az anaerobok maximális csökkenésének logaritmusa között . Mivel megnövekedett Candida pozitivitást találtunk az AAD betegeknél, az A+D- betegeknél és az A-D+ betegeknél, azt feltételezzük, hogy a baktériumok csökkenése a székletben, akár az antibiotikumos kezelés, akár a hasmenés hígulása miatt, lehetővé tette a Candida fajok terjedését, ami a Candida pozitivitás számának növekedését eredményezte

A vizsgálatunkban a Gram-festéssel festett keneteken mért átlagos élesztőszámok nem korreláltak a Candida kultúrákkal, ha sem az összes élesztőszámot számoltuk a tárgylemezeken (r=.27), sem a Danna és munkatársai által javasolt indexszel (r=,12). A fénymikroszkóp alatt megszámolt élesztőszerű sejtek nagy száma és a Candida fajok gyenge vagy hiányzó növekedése közötti ellentmondásról máshol már beszámoltak 15]. Ebben a tanulmányban a szerzők feltételezték, hogy a székletben mikroszkóp alatt kimutatott élesztőgombák nagy többsége nem volt élő . Eredményeink azt jelezték, hogy nagy körültekintéssel kell eljárni az AAD-ban szenvedő, Candida fajokra pozitív székletminták értelmezésekor. Ezekben a betegekben komolyan megkérdőjeleződik a széklet Candida-szám tenyésztéssel vagy diapozitív kenettel történő elemzésének hasznossága. A leukociták hiánya a Gram-festéssel festett mintákban összhangban volt a korábbi eredményekkel . Eredményeink azt is megerősítették, hogy a Candida fajok a normális bélflóra részét képezik

A Candida okozta AAD mechanizmusaként a gombatoxin vagy toxinszerű anyagok által közvetített aktív szekréciót vitatták . Mivel a szappanok a Candida-fertőzések fő virulenciafaktorai , ezeket a proteinázokat vizsgáltuk in vitro. Eddig 10 különböző SAP gént azonosítottak a C. albicansban . Mivel a jelentések szerint a SAP hozzájárul a szövetkárosodáshoz a humán orális candidosis modelljében , ezek a proteinázok a bélhámsejteket is károsíthatják. Azonban 8 betegnél, akiknél a Candida okozta AAD gyanúja merült fel, nem volt bizonyíték colitisre vagy sejtkárosodásra

Vizsgálatunkban az összes vizsgált C. albicans törzs termelt Sap-ot, és nem volt szignifikáns különbség az AAD betegek és a kontrollszemélyek Candida izolátumaiban termelt Sap mennyisége között. Az akut és krónikus hasmenésben szenvedő gyermekeknél magasabb szekretoros Candida savas proteinázok szintjét találtuk, mint az egészséges kontrollszemélyeknél . Bár az akut vagy krónikus hasmenésben szenvedő gyermekek teljes csoportjára számított Sap-szintek szignifikánsan magasabbak voltak, mint a kontrollszemélyek szintjei, ez nem volt igaz az egyes esetekre. A 9 Candida izolátum közül 4 kontrollszemély (hasmenés nélküli gyermekek) Sap-szintje hasonló volt a krónikus hasmenésben szenvedő gyermekek Sap-szintjéhez, és a 9 kontrollszemély közül 2-nél volt az akut hasmenésben szenvedő gyermekek Sap-szintjéhez hasonló. E magas Sap-szintek ellenére a kontrollszemélyeknek nem volt hasmenésük. Ez ellentétben áll a korábbi vizsgálatok eredményeivel, amelyekben a Sap-termelés a tüneteket mutató betegeknél mindig magasabb szintet ért el, mint a kontrollszemélyeknél: A hüvelygyulladásos betegekből származó Candida fajok Sap termelése mindig meghaladta a hordozó Candida fajok Sap termelését, és az AIDS-betegek orális candidiasisából származó Candida törzsek ∼8-szor több Sapot termeltek, mint a kontrollszemélyek izolátumai

A Sap termelést koherensen jelzi a BSA agar teszt és az ELISA . Sőt, az in vitro szekretált és BSA agar vagy ELISA módszerrel kimutatott magas Sap szintek korreláltak a Sap in vivo megnövekedett szintjeivel (pl. HIV-pozitív hüvelygyulladásos betegek hüvelyi folyadékában) . Feltételezhető, hogy a Candida fajok átmenetileg magas Sap-szintet termelnek in vivo, de elveszítik ezt a képességüket, például a szubkultúrázás miatt. A szájüregből izolált C. albicans esetében kimutatták, hogy az emelkedett Sap-termelés stabil jellemző. Másrészt az alacsony proteináztermelésű C. albicans izolátumok ismételt szubkultúrázások során stabil, alacsony szintű Sap termelést mutattak

Összefoglalva, vizsgálatunk eredményei nem erősítik meg a Candida okozta AAD korábban feltételezett patogenetikai mechanizmusait . Adataink arra utalnak, hogy az emelkedett Candida-szám inkább az antibiotikum-kezelés vagy a hasmenés következménye, mintsem az AAD oka. Az AAD-ban szenvedő betegeknél a Sap fő gombavírulenciafaktor termelése nem különbözött a kontrollszemélyekétől, ami arra utal, hogy ez a gombatoxin nem lehet felelős a felnőttek AAD-ért. Más gombavirulenciafaktorok (pl. phospholipases) warrant further investigation