Długotrwałe zwiększenie masy i siły mięśni szkieletowych przez pojedyncze podawanie genów inhibitorów miostatyny
Wyniki i dyskusja
Dostarczanie genów do mięśni za pośrednictwemAAV zapewnia system generowania wysokich poziomów białka w tkance docelowej lub przez wydzielony produkt przenoszony do odległych miejsc przez krążenie (19). Sklonowaliśmy znane wydzielane geny hamujące miostatynę, w tym białko surowicy związane z czynnikiem wzrostu i różnicowania-1 (GASP-1) (18), gen związany z follistatyną (FLRG) (17) i follistatynę-344 (FS) (13) do serotypu 1 AAV, które wykazały wysoką zdolność transdukcji mięśni. Istnieją dwie izoformy follistatyny powstałe w wyniku alternatywnego splicingu. Wariant FS-344 ulega rozszczepieniu peptydowemu w celu wytworzenia izoformy FS-315, a drugi wariant FS-317 wytwarza izoformę FS-288 po rozszczepieniu peptydowym. Użyliśmy ludzkiego wariantu FS-344, który generuje wyłącznie krążącą w surowicy izoformę FS-315 i zawiera C-końcowy region kwaśny (20). Wybraliśmy FS-344 (FS), ponieważ inna izoforma FS-317, pozbawiona końcówki C, wykazuje preferencyjną lokalizację w płynie pęcherzykowym jajnika i wysokie powinowactwo do wiązania tkankowego poprzez proteoglikany siarczanu heparyny, co może wpływać na zdolność reprodukcyjną i wiązać się z innymi miejscami poza celem (21). FS-288 reprezentuje związaną z błoną formę follistatyny (22), jest silnym supresorem hormonu stymulującego pęcherzyki przysadki (23), występuje w płynie pęcherzykowym jajnika i w jądrach oraz wykazuje wysokie powinowactwo do komórek ziarnistych jajnika.
Próbowaliśmy określić skuteczność tych białek w zwiększaniu masy mięśniowej u myszy normalnych i dystroficznych. Podawaliśmy 1 × 1011 cząstek wirusowych AAV1 na zwierzę kodujących FS, FLRG, GASP-1 lub GFP obustronnie do mięśni czworogłowych i piszczelowych przednich 4-tygodniowych myszy C57BL/6 typu dzikiego. Wszystkie zwierzęta leczone inhibitorami miostatyny wykazały wzrost masy ciała z obserwowalnym wzmocnieniem mięśni podczas analizy w 725 dniu życia w porównaniu z kontrolami leczonymi GFP (Fig. 1 a i b). Ocena masy poszczególnych mięśni wykazała wzrost masy mięśniowej u wszystkich zwierząt leczonych inhibitorami miostatyny, z największym wzrostem u zwierząt leczonych FS. Wzrost masy mięśniowej stwierdzono w ostrzykiwanych mięśniach kończyny tylnej oraz w mięśniach odległych od miejsca iniekcji, takich jak mięsień trójgłowy. Inhibitory te były więc wydzielane do krążenia z miejsca wstrzyknięcia do mięśnia, zwiększając masę mięśni szkieletowych w miejscach odległych (ryc. 1 c). Powiększeniu masy mięśniowej towarzyszyła poprawa funkcjonalna wyrażająca się wzrostem siły uścisku kończyn tylnych (ryc. 1 d). Nie stwierdzono wpływu na masę serca ani na wygląd histologiczny kardiomiocytów, co wskazuje, że inhibicja miostatyny była selektywna w stosunku do tkanki mięśni szkieletowych (dane nie pokazane). Istnieją obawy, że FS wpływa niekorzystnie na funkcje gonad. Nie stwierdziliśmy żadnych zmian w zdolności reprodukcyjnej u myszy leczonych naszym AAV1 niosącym transgen FS344 (AAV1-FS, Tabela 1) Ponadto nie stwierdziliśmy żadnych zmian histologicznych/patologicznych w tkance gonad myszy leczonych FS w porównaniu z kontrolami (dane nie pokazane).
Białka inhibitorów miostatyny zwiększają masę i siłę mięśni u myszy C57BL/6 wild-type. (a) Masa mięśniowa brutto kończyny tylnej jest zwiększona u wszystkich myszy leczonych inhibitorem miostatyny w wieku 725 dni w porównaniu z kontrolami wstrzykniętymi AAV1-GFP. (b) Całkowita masa ciała jest znacząco zwiększona u myszy poddanych iniekcji AAV1-FS (**, P ≤ 0,01) i AAV1-GASP-1 (*, P ≤ 0,05) w porównaniu z kontrolami AAV1-GFP w wieku 725 dni (n = 10). (c) Masa poszczególnych mięśni kończyny tylnej i przedniej jest zwiększona u myszy wstrzykniętych z AAV wyrażającym białka inhibitora miostatyny (n = 10). *, P ≤ 0.05. (d) Siła uchwytu kończyny tylnej poprawia się >2 lata u wszystkich leczonych myszy, z największymi różnicami u zwierząt leczonych AAV1-FS w porównaniu z kontrolami AAV1-GFP (n = 10). Słupki błędów przedstawiają błąd standardowy.
- View inline
- View popup
Reprodukcja była normalna u zwierząt leczonych AAV1-FS
Zważywszy na solidne efekty dostarczania FS, przetestowaliśmy następnie potencjał AAV1-FS dostarczanego postnatalnie w paradygmacie mającym znaczenie kliniczne w celu zwiększenia masy i siły mięśni oraz opóźnienia pogorszenia mięśni w modelu myszy mdx dystrofii mięśniowej Duchenne’a (DMD). DMD jest chorobą recesywną sprzężoną z chromosomem X, powodującą zanik mięśni szkieletowych i funkcji serca, co ostatecznie prowadzi do śmierci. Ostatnio badano FS u zwierząt mdx nadekspresjonujących zduplikowaną domenę genu follistatyny. Wyniki wykazały zwiększenie masy mięśniowej i osłabienie patologii, chociaż wyniki te były udokumentowane tylko do 15 tygodnia życia (24). W naszych badaniach zwierzętom mdx wstrzykiwano obustronnie w mięśnie czworogłowe i piszczelowe przednie niską (1 × 1010 cząstek wirusowych) lub wysoką dawkę (1 × 1011 cząstek wirusowych) AAV1-FS w wieku 3 tygodni i śledzono przez 5 miesięcy przed sekcją zwłok. Zwiększone poziomy krążącego FS wykryto w surowicy zarówno zwierząt leczonych niską, jak i wysoką dawką, przy czym wysoka dawka wyrażała największy poziom FS wykrytego w surowicy (wysoka dawka, 15,3 ± 2,1 ng/ml; niska dawka, 6,8 ± 0,4 ng/ml; kontrole GFP, 0 ± 0,1 ng/ml; n = 8 na grupę; P < 0,01). Wykazaliśmy, że AAV1-FS zwiększył masę ciała w porównaniu z kontrolami traktowanymi GFP, z największym wzrostem w grupie FS o wysokiej dawce (dane nie pokazane). Obserwacje brutto myszy leczonych AAV1-FS wykazały znaczący wzrost wielkości mięśni w porównaniu ze zwierzętami leczonymi AAV1-GFP (ryc. 2 a), z największym indywidualnym wzrostem masy mięśniowej u zwierząt leczonych wysoką dawką FS (ryc. 2 b). Efekty te nie były ograniczone do mięśni poddanych iniekcji; stwierdzono je również w miejscach odległych od mięśni, na które bezpośrednio oddziaływano (ryc. 2 b). Zwiększona masa mięśniowa przekładała się na zależną od dawki poprawę siły mięśniowej w kończynach tylnych i przednich leczonych zwierząt w porównaniu z kontrolami leczonymi GFP (ryc. 2 c). Analizy histologiczne i morfometryczne mięśni wstrzykniętych AAV1-FS oraz w miejscach odległych wykazały przerost włókien mięśniowych, potwierdzając obserwacje brutto poczynione w czasie sekcji zwłok (ryc. 3 a-c). Ponadto, nie zaobserwowano zmiany w typach włókien mięśniowych u zwierząt leczonych AAV-FS; jednakże, było mniej całkowitych włókien na milimetr kwadratowy powierzchni w mięśniu piszczelowym przednim u zwierząt leczonych wysoką dawką AAV-FS (Ryc. 3 d i e). Uderzające jest to, że myszy, którym podawano FS, wykazywały znaczące zmniejszenie stężenia kinazy kreatynowej w surowicy w porównaniu z kontrolami, którym podawano GFP (ryc. 4 a). Jest to interesujące, ponieważ FS działała ochronnie pomimo braku korekcji podstawowego niedoboru dystrofiny. Dokładny mechanizm nie jest jasny, ale można spekulować, że zwiększenie wytrzymałości poszczególnych włókien czyni je mniej podatnymi na uszkodzenia w wyniku stresu związanego z normalną aktywnością. Udział komórek satelitarnych w postnatalnym hamowaniu miostatyny pozostaje do pełnego rozstrzygnięcia; jednak nie zaobserwowaliśmy statystycznej zmiany w markerach komórek satelitarnych mięśni u zwierząt leczonych FS (dane nie pokazane).
Pojedyncza iniekcja AAV1-FS zwiększa masę mięśniową i siłę u młodych myszy mdx. (a) Masa mięśniowa brutto kończyny tylnej jest zwiększona u zwierząt mdx wstrzykniętych AAV1-FS w wieku 180 dni w porównaniu z kontrolami wstrzykniętymi AAV1-GFP. (b) Masa poszczególnych mięśni kończyny tylnej i przedniej jest zwiększona w wieku 180 dni u myszy wstrzykniętych w wieku 3 tygodni za pomocą AAV1-FS w porównaniu z kontrolami AAV1-GFP (n = 15). *, P ≤ 0.05. (c) Siła chwytu poprawia się w sposób zależny od dawki u młodych myszy mdx wstrzykiwanych w wieku 3 tygodni z AAV1-FS, a następnie przez 180 dni (n = 15). Czerwony, wysoka dawka AAV1-FS; niebieski, niska dawka AAV1-FS; zielony, kontrola AAV1-GFP. Słupki błędów przedstawiają błędy standardowe.
Myszy mdx traktowane AAV1-FS w wieku 3 tygodni i śledzone przez 180 dni wykazują hipertrofię miofibryli. (a) H&E staining of the tibialis anterior reveals myofiber hypertrophy in AAV1-FS injected muscle compared with AAV1-GFP control. (Oryginalne powiększenie, ×40.) (b) Średnia średnica ciemnych (wolnoprzepływowych oksydacyjnych), pośrednich (szybkoprzepływowych oksydacyjnych glikolitycznych) i jasnych (szybkoprzepływowych glikolitycznych) miofibrów w przedniej części piszczeli (wskazana przez zakreskowaną linię) jest znacząco zwiększona u myszy wstrzykniętych z AAV1-FS w porównaniu do kontroli wstrzykniętych z AAV1-GFP. (P < 0,001; n = 5). (c) Średnia średnica pośrednich i lekkich włókien mięśniowych (wskazana przez zakreskowaną linię) w mięśniu trójgłowym jest znacząco zwiększona u myszy wstrzykiwanych z AAV1-FS w porównaniu z kontrolami wstrzykiwanymi z AAV1-GFP. (P < 0.001; n = 5.) (d) Dystrybucja ciemnych, pośrednich i jasnych włókien określona przez barwienie dehydrogenazą bursztynową (SDH) nie jest zmieniona przez leczenie wysokimi lub niskimi dawkami AAV1-FS. (P > 0,05 między wszystkimi grupami; n = 5.) (e) Średnia liczba włókien liczonych na nieobiektywnej ramce liczącej 0,14 mm2 jest zmniejszona w piszczeli przedniej myszy leczonych AAV1-FS, biorąc pod uwagę, że średnia średnica miofibrów jest zwiększona. (*, P < 0,01; n = 5.) Słupki błędów przedstawiają błędy standardowe.
Myszy mdx leczone AAV1-FS wykazują zmniejszone markery uszkodzenia mięśni, a starzejące się myszy mdx odpowiadają na leczenie FS z korzyścią funkcjonalną. (a) Poziom kinazy kreatynowej w surowicy (jednostki/litr) jest obniżony w 3 miesiące po wstrzyknięciu AAV1-FS w porównaniu z kontrolą wstrzykniętą AAV1-GFP. (*, P < 0,05; n = 10.) Słupki błędów reprezentują błędy standardowe. (b) Siła chwytu kończyn tylnych jest znacząco zwiększona (P ≤ 0,05) w 275 dniu i później u starzejących się myszy mdx, którym podano AAV1-FS w 210 dniu życia (n = 15). Czerwony, wysoka dawka AAV1-FS; zielony, kontrola AAV1-GFP. (c) Barwienie H&E starzejącego się mięśnia brzuchatego wykazuje zmniejszoną patologię po wstrzyknięciu FS w 210 dniu życia w porównaniu z kontrolami wstrzykniętymi GFP. (Oryginalne powiększenie, ×40.) (d) H&E stained diaphragm of animals injected at 210 days of age with FS shows less fat replacement than GFP-injected controls at late stage. (Oryginalne powiększenie, ×20.)
Oceniliśmy również potencjał AAV1-FS do zwiększenia siły mięśniowej u zwierząt mdx, gdy traktowano je w starszym wieku. Stwierdziliśmy, że wstrzyknięcie AAV1-FS w wieku 210 dni zwiększyło siłę mięśni ≈60 dni po podaniu i że zwiększona siła utrzymywała się długoterminowo przez 560 dni ocenianych w tym badaniu (ryc. 4 b). Już w 180 dniu życia, przed leczeniem AAV1-FS, w mięśniach nieleczonych zwierząt mdx występowała wyraźna patologia, z widoczną śródmięśniową proliferacją tkanki łącznej i stanem zapalnym (ryc. 4 c i d). Ocena patologiczna mięśni brzuchatych łydek i przepony w 560 dniu życia wykazała, że zwierzęta leczone AAV1-FS miały znacznie mniej ognisk martwiczych włókien mięśniowych i nacieków komórek jednojądrzastych. Co ważne, zwierzęta leczone AAV1-FS miały znacząco zredukowane ogniska proliferacji śródmięśniowej tkanki łącznej, które były wyraźne u zwierząt leczonych GFP, wykazując, że zwłóknienie, cecha dystrofii mięśniowej, było zredukowane u zwierząt leczonych FS (Rys. 4 c). Patologia w przeponie również wykazała, że leczenie FS zmniejszyło stan zapalny i wymianę tłuszczową w porównaniu ze zwierzętami leczonymi GFP (ryc. 4 d). Ponadto, leczenie AAV1-FS wykazało znaczący wzrost średnicy włókien mięśniowych w tym wieku w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi, którym podawano GFP (ryc. 4 c i d). Wyniki te wykazały, że hamowanie miostatyny przez leczenie FS było korzystne u starzejących się zwierząt mdx, które przeszły wiele rund degeneracji i regeneracji mięśni. Przełożenie na równoległe badania kliniczne sugeruje, że terapia genowa FS z udziałem AAV może mieć potencjał dla starszych pacjentów z DMD niezależnie od zastąpienia brakującego genu i może mieć potencjalną rolę w terapii kombinowanej podobnej do tej, jaką wykazano dla zastąpienia genów IGF-1 i minidystrofiny (25).
Wyniki te sugerują, że hamowanie miostatyny przez FS-344, dostarczane przez pojedynczą iniekcję AAV1, może zwiększyć rozmiar i siłę mięśni i jest dobrze tolerowane przez >2 lata. Wyniki FS344 mogą oferować silniejszą strategię niż inne ukierunkowane wyłącznie na miostatynę ze względu na efekty dodatkowe, takie jak zaangażowanie follistatyny w wiele szlaków sygnałowych, a także ostatnie odkrycie wykazujące zmniejszenie stanu zapalnego w modelu endotoksemii (15, 26). Uderzająca zdolność FS do zapewnienia długotrwałej poprawy brutto i funkcjonalnej mięśni dystroficznych u zwierząt w podeszłym wieku uzasadnia rozważenie jej zastosowania w rozwoju klinicznym w leczeniu chorób układu mięśniowo-szkieletowego, w tym u starszych pacjentów z DMD.