PMC

Ten wykład jest oparty na najnowszym przeglądzie.

Wzrastające obciążenie cukrzycą na całym świecie jest dobrze znane, a wpływ na koszty opieki zdrowotnej oraz ludzkie cierpienie, zachorowalność i śmiertelność będzie przede wszystkim odczuwalny w krajach rozwijających się, w tym w Indiach, Chinach i krajach Afryki. Nowe leki są opracowywane w szybkim tempie, a w ciągu ostatnich kilku lat pojawiło się kilka nowych klas związków do leczenia cukrzycy, np. mimetyki glukagonopodobnego peptydu (GLP-1), inhibitory dipeptydylo-peptydazy-4 (DPP-4), inhibitory sodowego transportera glukozy-2 (SGLT2). Coraz częściej dostępne i propagowane są również nowe metody leczenia chirurgicznego jako skuteczna terapia cukrzycy. W ostatnich latach wprowadzono operacje ograniczenia żołądka, ominięcia żołądka, jednoczesnego przeszczepienia trzustki i nerki oraz przeszczepienia trzustki i wysepek. Aby uniknąć traumy związanej z poważną operacją, przeprowadzono wiele badań nad przeszczepianiem izolowanych wysepek pobranych z trzustki. Zachętą był „protokół z Edmonton” opisany przez Shapiro i współpracowników w New England Journal w 2000 roku. Wysepki były wstrzykiwane do żyły wrotnej i pacjenci, zwłaszcza ci cierpiący na niebezpieczną, nieświadomą hipoglikemię, byli leczeni zanim rozwinęły się u nich poważne powikłania cukrzycy, zwłaszcza powikłania nerkowe. Podczas gdy wczesne wyniki były obiecujące, około 70% pacjentów nie wymagało wstrzyknięć insuliny po dwóch latach, po pięciu latach u większości z tych pacjentów nastąpiło pogorszenie i wymagali oni suplementacji insuliną, pomimo tego, że niektórzy z nich otrzymali więcej niż jeden przeszczep wysepek. W nowszych seriach pacjentów grupa z Edmonton odnotowała lepsze wyniki długoterminowe przy zastosowaniu przeciwciała monoklonalnego przeciwko limfocytom, Campath 1H, podawanego jako czynnik indukujący, 45% pacjentów było niezależnych od insuliny po pięciu latach, a 75% miało wykrywalny peptyd C.

Jednakże trzustka kadawarowa i wysepki konkurują o to samo źródło i są ograniczone pod względem liczby, a zatem żaden z tych sposobów leczenia nie mógł być łatwo zaoferowany zdecydowanej większości pacjentów z cukrzycą. Niektórzy próbowali wykorzystać alternatywne źródło, na przykład kapsułkowane wysepki pochodzące od noworodków lub dorosłych świń. Jest to nadal bardzo eksperymentalne i będzie odległą alternatywą z wieloma technicznymi i prawdopodobnie etycznymi przeszkodami do pokonania.

Ostatnio, wraz z sukcesami w rozwoju pluripotencjalnych dorosłych komórek macierzystych (od Yamanaka, nagrodzonego w 2012 roku nagrodą Nobla w dziedzinie medycyny za rozwój indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych – iPSCs), próbowano nowych podejść do poszukiwania metod, które mogą być bardziej dostępne i osiągalne. Początkowo duże nadzieje wiązano z badaniami nad embrionalnymi komórkami macierzystymi (ESC), ponieważ komórki te można nakłonić do namnażania się i rozwoju w dowolną tkankę, jednak proces ten był kosztowny, a problem powstawania teratoma z tych komórek macierzystych okazał się niezwykle trudny do pokonania. Wiele ważnych czynników związanych z rozwojem płodu jest niezrozumiałych i nie da się ich odtworzyć. Poczyniono jednak pewne postępy i (sporadycznie) nakłoniono komórki do wydzielania insuliny, ale jak dotąd zastosowanie terapeutyczne było bardzo minimalne.

Naukowcy są obecnie świadomi, że nakłonienie komórki do produkcji insuliny to tylko jeden krok w długiej i trudnej podróży. Komórki wysepek są wysoce wyspecjalizowane nie tylko do podstawowego wydzielania insuliny, ale także do szybkiego reagowania na zmiany stężenia glukozy we krwi. W przypadku insuliny proces i regulacja wyłączania wydzielania jest równie ważny jak włączanie wydzielania.

Wykonano wiele różnych podejść z różnymi punktami wyjścia. Komórka macierzysta rozmnaża się sama, a następnie może dzielić się asymetrycznie i tworzyć inny typ komórki: Jest to znane jako różnicowanie. Chociaż początkowo sądzono, że są one dostępne tylko z embrionów, nieembrionalne komórki macierzyste można obecnie uzyskać bez większych trudności z tkanek noworodków, pępowiny, a także z różnych tkanek dorosłych, w tym szpiku kostnego, skóry i tłuszczu. Te komórki macierzyste mogą być ekspandowane i różnicowane, ale ich repertuar jest ograniczony w porównaniu z embrionalnymi komórkami macierzystymi: oligo- lub pluri- w przeciwieństwie do toti-potencjalnych embrionalnych komórek macierzystych. Co więcej, ostatnio dużym zainteresowaniem cieszy się proces bezpośredniego transdyferencjacji komórek, w którym zaangażowana i w pełni zróżnicowana komórka, na przykład komórka wątroby, jest zmieniana bezpośrednio w inny typ komórki, na przykład komórkę beta wysepki, bez indukcji de-dyferencjacji z powrotem do stadium komórki macierzystej.

Yamanaka, w 2006 roku, był w stanie wyprodukować pluripotencjalne komórki macierzyste z hodowli neonatalnych i dorosłych fibroblastów myszy poprzez dodanie koktajlu czterech zdefiniowanych czynników. Doprowadziło to do serii innych badań rozwijających ten proces, który okazał się powtarzalny zarówno w przypadku tkanek ludzkich, jak i myszy laboratoryjnych. Wykorzystanie komórek iPS pozwoliło uniknąć ograniczeń etycznych związanych z wykorzystaniem ludzkich embrionów, ale nadal istniały inne problemy i przeszkody. Pojawiają się doniesienia, że komórki iPS stają się antygenowe w stosunku do autologicznego lub izologicznego gospodarza, a komórki te mogą gromadzić nieprawidłowości DNA, a nawet zachowywać pamięć epigenetyczną typu komórki, z której pochodzą, przez co mają tendencję do powrotu do poprzedniego stanu. Podobnie jak embrionalne komórki macierzyste, komórki iPS mogą tworzyć teratoma, zwłaszcza jeśli różnicowanie nie jest całkowite.

Mimo to, sukces w kierowaniu różnicowaniem iPSC w celu utworzenia komórek beta wysepek w wystarczającej ilości, które będą wydzielać i zatrzymywać wydzielanie w odpowiedzi na zmiany poziomu glukozy we krwi, jest bardzo niewielki.

Innym podejściem, które zostało wypróbowane, jest połączenie terapii genowej z komórkami macierzystymi. Poczyniono pewne postępy w próbach ekspresji pożądanego genu insuliny w bardziej prymitywnych, niezróżnicowanych komórkach poprzez koaksję komórek macierzystych z czynnikami różnicującymi in vitro, a następnie poprzez bezpośrednią transfekcję genów przy użyciu plazmidów lub wektora wirusowego. My, i inni, wykorzystaliśmy konstrukt genu ludzkiej insuliny i wprowadziliśmy go ex vivo lub in vivo do komórek przez bezpośrednią elektroporację (oczywiście w komórkach ex vivo) lub przez wektory wirusowe. Najbardziej zbadano adenowirusy, wirusy adeno-associated i różne wirusy retro, zwłaszcza Lentiwirusy. Jednak każdy rodzaj inżynierii genetycznej budzi obawy nie tylko przed zakażeniem wirusem, ale także przed ujawnieniem onkogenów, co może prowadzić do nowotworów złośliwych, dlatego też istnieją ścisłe regulacje dotyczące postępowania w celu uniknięcia tego ryzyka.

Zainteresowaliśmy się komórkami macierzystymi z pępowiny oraz mezenchymalnymi komórkami macierzystymi jako celami dla skojarzonej terapii komórkami macierzystymi i genami. Komórki te można uzyskać w dość łatwy i powtarzalny sposób z wyrzuconej w inny sposób pępowiny lub łatwo dostępnego szpiku kostnego, wybierając komórki przy użyciu różnych standardowych technik. Tłuszcz, owodnia i krew pępowinowa są również źródłami, z których można uzyskać meznechymalne komórki macierzyste. Po fazie proliferacyjnej komórki przybierają wygląd zbliżony do dywanu fibroblastów, które mogą różnicować się w komórki kostne, chrzęstne lub tłuszczowe. Chociaż mezenchymalne komórki macierzyste z różnych wymienionych źródeł mogą wyglądać podobnie, ich potencjał różnicowania jest idiosynkratyczny i różny, co sprawia, że niewłaściwe i trudne jest myślenie o nich jako o jednolitym źródle komórek docelowych. Komórki błon płodowych noworodków i komórki pępowiny mają niską immunogenność i nie wykazują ekspresji antygenów HLA klasy II. Wydzielają również czynniki hamujące reakcje immunologiczne, np. rozpuszczalne HLA-G. Mimo znacznego zmniejszenia immunogenności, nadal nie są to komórki autologiczne, co wiąże się z ryzykiem odrzucenia alloprzeszczepu. Ich zaletą jest to, że mogą być namnażane, zamrażane i przechowywane w banku w dużych ilościach i mogą być stosowane u pacjentów już potrzebujących środków immunosupresyjnych, na przykład u osób po przeszczepie nerki.

W Singapurze nasze badania nad komórkami błoniastymi pochodzącymi z pępowiny wykazały pewien sukces w ekspresji genów insuliny i glukagonu, ale mało lub brak wydzielania insuliny in vitro. Wraz z transfekcją genów insuliny in vitro, po przeszczepieniu do otrzewnej u myszy z cukrzycą indukowaną sterptozotocyną, nastąpiła pewna poprawa poziomu glukozy. Nasi koledzy z Singapuru zastosowali inny model autologicznych hepatocytów pochodzących od świń z cukrzycą indukowaną streptozocyną. Te oddzielone hepatocyty zostały z powodzeniem zainfekowane ex-vivo konstruktem genu ludzkiej insuliny za pomocą elektroforezy, a następnie komórki zostały wstrzyknięte z powrotem bezpośrednio do miąższu wątroby za pomocą wielu oddzielnych wstrzyknięć. Świnie zostały wyleczone z cukrzycy na okres do dziewięciu miesięcy – co jest niezwykłym osiągnięciem. Ponieważ były to autotransplantacje, nie były konieczne żadne leki immunosupresyjne, ale komórki wątroby uzyskano z dużych otwartych biopsji chirurgicznych. Konieczność chirurgicznego usunięcia tkanki wątroby ograniczyłaby możliwość zastosowania tej metody, ale mimo to było to dobre badanie typu proof of concept. W kontekście cukrzycy autoimmunologicznej ryzyko nawrotu choroby może się utrzymywać, jeśli nie uda się zdefiniować i wyeliminować celu ataku autoimmunologicznego. W tych doświadczeniach u świń wykorzystano ludzki gen insuliny z promotorem EGR-1 wyczuwającym glukozę. Nie było wirusa, a plazmid nie integruje się. Podział transfekowanej komórki spowodowałby rozcieńczenie aktywności genu, ale duża liczba plazmidów może być produkowana tanio. Ta sama grupa pracowników z powodzeniem transfekowała mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego plazmidem z ludzkim genem insuliny przy użyciu tego samego promotora EGR-1 i elektroporacji. Pozwoliło to na wyleczenie myszy z cukrzycą po bezpośrednim wstrzyknięciu do wątroby i dootrzewnowo.

Na koniec należy zachować ostrożność w interpretacji wyników tych i innych doniesień dotyczących terapii komórkowej i genowej w cukrzycy. In gene transfection and/or transplantation of insulin-producing cells or clusters in the diabetic rodent, there have been many reports in the literature, but only a few of these claims have been reproduced in independent laboratories. We have suggested the need to satisfy „The Seven Pillars of Credibility” as essential criteria in the evaluation of claims of success in the use of stem cell and/or gene therapy for diabetes.

1. Cure of hyperglycemia

2. Response to glucose tolerance test

3. Evidence of appropriate C-peptide secretion

4. Weight gain

5. Prompt return of diabetes when the transfecting gene and/or insulin producing cells are removed

6. No islet regeneration of stereptozotocin-treated animals and no re-generation of pancreas in pancreatectomized animals

7. Presence of insulin storage granules in the treated cells