PMC

SLTEC INNE NIŻ O157 : H7 W CHINACH

E. coli O157 : H7 nie była do tej pory uznawana za duży problem zdrowia publicznego w Chinach. Jednakże, STEC wydaje się być poważnym problemem. W klinicznych lub publicznych laboratoriach bakteriologicznych, tylko EPEC, ETEC i EIEC były diagnozowane za pomocą technik serotypowania. Niemniej jednak, nierzadko obserwowano niemal czyste kultury E. coli i nowe odmiany E. coli izolowane z niektórych próbek kału pacjentów z biegunką, których nie można było oznaczyć przy użyciu dostępnych typów serotypów. Czy powinny być one uznane za patogenne E. coli, czy też nie, pozostaje nadal kwestią sporną. Założyliśmy, że część z tych szczepów izolowanych jako E. coli może mieć charakter patogenny, co zostało przeoczone z powodu braku odpowiednich technik identyfikacji. Aby zweryfikować tę hipotezę, zebraliśmy 174 nazwane niepatogenne szczepy E. coli w Pekinie w latach 1988-1990 i wykryliśmy je za pomocą sond DNA. Sondy DNA obejmowały prawie wszystkie zgłoszone geny wirulencji, takie jak toksyna termostabilna (ST), toksyna termolabilna (LT), czynnik adherencji EPEC (EAF), gen adherencji rozproszonej (DA), sonda specyficzna dla EHEC pCVD419, sonda specyficzna dla EAggEC, 2.5 Kb specyficznej sondy dla plazmidu inwazyjnego (INV) gatunków EIEC i Shigella, toksyny shig a-podobnej 1 lub 2 (SLT1 lub SLT2), genów przyłączania i usuwania EPEC (eae). Zaobserwowano, że 59,3% badanych szczepów hybrydyzowało z przynajmniej jedną z zastosowanych sond, przy czym wyższy odsetek (29,7%) szczepów E. coli hybrydyzował z sondami SLT2 i INV.

Ogólnie szczepy EHEC i niektóre EPEC hybrydyzują z sondą SLT1 lub/i SLT2. Sonda INV jest 2,5-kb fragmentem pochodzącym z inwazyjnego plazmidu S.flexneri 2a, używanym jako narzędzie diagnostyczne specyficzne dla gatunków Shigella i szczepów EIEC. Fragment ten został następnie zsekwencjonowany i nazwany invasive associated locus (ial). Jednakże, żaden ze znanych gatunków EIEC lub Shigella flexneri nie hybrydyzował z sondami SLTs. Aby wyjaśnić związek pomiędzy EIEC a niektórymi wyizolowanymi szczepami, zsyntetyzowano metodą PCR antygen plazmidu inwazyjnego BCD (ipaBCD), geny kluczowe dla zdolności inwazyjnych EIEC i Shigella, znakowane Digoksyną i użyte jako sondy. Brak sygnałów hybrydyzacji DNA wskazywał na brak genów ipaBCD w E. coli F171. Stwierdzono również, że E. coli F171 nie mogła wywołać keratoconjunctivitis u świnek morskich. Test Sereny’ego był używany jako krytyczny marker wirulencji gatunków EIEC i Shigella. Jednakże, w teście na komórkach HEp-2, E. coli F171 jest zdolna do inwazji na komórki nabłonka. Dane te sugerują, że geny kodujące zdolność inwazyjną E. coli F171 różniły się od EIEC, a zatem E. coli F171 nie należała do EIEC.

Przyleganie bakterii do komórek nabłonka zostało uznane za cechę wirulencji patogenów jelitowych. Zdefiniowano trzy wzorce przylegania, tj. przyleganie zlokalizowane, przyleganie rozproszone i przyleganie agregacyjne. Wiele z naszych szczepów E. coli hybrydyzowanych z sondami DNA SLT2 i INV wykazywało wzór przylegania agregacyjnego do komórek HEp-2. Jednakże żaden z nich nie hybrydyzował z sondą specyficzną dla EAggEC, która pochodziła z genów kodujących czynnik przylegania EAggEC I (EAF/I) i była używana jako marker identyfikacyjny dla EAggEC. Cechą charakterystyczną szczepów EAggEC jest agregacyjny wzór przylegania do komórek HEp-2. W mikroskopie elektronowym na powierzchni komórek E. coli F171 zaobserwowano unikalny rodzaj fimbrii. Wielkość podjednostki białka fimbrii wynosiła 19KDa, a geny kodujące fimbrie umieszczono na plazmidzie o masie 60 MDa. Komórki E. coli HB101 zawierające sklonowane geny były zdolne do adhezji do komórek HEp-2. Analiza N-końcowej sekwencji aminokwasowej wykazała, że E. coli F171 posiada unikalne cechy.

Toksyny podobne do shiga zostały wykazane jako czynniki wirulencji szczepów E. coli, które mogą powodować HC i HUS. Wiele szczepów EPEC i EHEC zawiera geny dla SLT1 lub SLT2. Zdolność wytwarzania toksyn przez E. coli F171 badano za pomocą testu na komórkach Vero, który był pierwotnie stosowany do badania SLT, ponieważ E. coli F171 hybrydyzowała z sondą SLT2. Zarówno filtrat z hodowli komórkowej, jak i surowy preparat toksyny E. coli F171 okazały się toksyczne dla komórek Vero. Toksyczność E. coli F171 dla komórek Vero nie mogła być zneutralizowana przez przeciwciało SLT2. Fakt hybrydyzacji E. coli F171 z sondą SLT2 sugerował, że posiada ona fragment DNA homologiczny do genu SLT2 lub posiada cały gen SLT2.

Inwazyjność, aktywność wytwarzania toksyn i zdolność przylegania do komórek nabłonka zostały opisane jako kluczowe cechy odpowiednio dla EIEC, ETEC i EAggEC. E. coli F171 może przylegać i wnikać do komórek HEp-2 oraz produkować toksyny. Łączy ona w sobie wiele kluczowych cech EIEC, EHEC, EPEC i EAggEC. Na podstawie uzyskanych danych wydaje się, że E. coli F171 reprezentuje nową odmianę STEC. Stąd zaproponowano nazwę: enteric SLTs-producing and invasive E. coli (ESIEC). Ponieważ 31,4% zebranych szczepów E. coli badanych w naszych badaniach miało podobne cechy jak E. coli F171, infekcje przypuszczalnie wywołane przez ten rodzaj patogennej E. coli wydają się być ważnym problemem zdrowia publicznego w Chinach.

W celu potwierdzenia zjadliwości i patogenezy u ludzi przeprowadzono badanie na dorosłych ochotnikach. Po podaniu doustnym 109-1010 jednostek tworzących kolonię (CFU) E. coli F171, u wszystkich z 8 ochotników rozwinęła się biegunka, u 3 z 8 wystąpiła wysoka gorączka (39,8 °C). Okres inkubacji wynosił od 7 do 49 h. Nieuformowane stolce występowały 3-6 razy dziennie. Objętość stolca u 4 ochotników wynosiła ponad 1000 ml na dobę. Antybiotykoterapię zastosowano u 5 z 8 ochotników. W grupie kontrolnej składającej się z 4 ochotników, którzy spożyli 109 CFU niepatogennego szczepu E. coli-HB101, nie zaobserwowano biegunki. Typowymi objawami klinicznymi dla ESIEC u ochotników były: ruchy misek, biegunka, ogólne bóle brzucha, umiarkowana gorączka i nieuformowany stolec. Wykazano, że spożyta E. coli F171 może kolonizować się i replikować przez okres do 7 dni. Badając próbki kału ochotników, zaobserwowano, że bakteria mogła osiągnąć ilość 2,74 × 1012 CFU. Szczepy wyizolowane z próbek stolca ochotników zostały potwierdzone jako E. coli F171 przez swoistą przeciw nim surowicę u zwierząt.

Mimo, że chorobotwórczy charakter E. coli F171 dla człowieka został poznany, kluczowe czynniki wirulencji ESIEC nie zostały szczegółowo zbadane. Na przykład, mechanizm patogenności ESIEC nie został zrozumiany. Wyspa patogenności”, która odnosi się do dużego segmentu chromosomalnego niosącego geny zaangażowane w patogenność, zrewolucjonizowała ostatnio nasze rozumienie patogenezy bakterii. Zawartość GC w wyspach patogenności jest inna niż w pozostałych chromosomach gospodarza, co sugeruje, że mogą one pochodzić z poziomego transferu pomiędzy różnymi bakteriami. Liczba gatunków bakterii Gram-ujemnych, o których wiadomo, że są nosicielami wysp patogenności stale rośnie, włączając w to uropatogenne E. coli (UPEC), EHEC, EPEC, Helicobacter pylori, Salmonella typhimurium i Vibrio cholerae. Uważa się, że nie ma wyspy patogenności w niepatogennych E. coli. Musimy zbadać wyspę patogenności, aby potwierdzić znaczenie medyczne ESIEC. Ostatnio zaobserwowaliśmy gen irp2 w wielu szczepach ESIEC. Gen irp2 jest zaangażowany w wychwyt żelaza i został uznany za jeden z genów wirulencji zlokalizowanych na wyspie wysokiej patogenności (HPI) Yersinia-species. Gen ten obserwowano u wielu szczepów E. coli przylegających do podłoża oraz u E. coli izolowanych z krwi, ale rzadko u EPEC, EIEC czy ETEC. Nie-irp2-występował w szczepach EHEC, Shigella i Salmonella enterica. Wydaje się, że wyspa patogenności istniała w ESIEC. HPI Y. pestis jest rozpowszechniony wśród gatunków z rodziny Enterobacteriaceae, które są patogenne dla człowieka.