Rola Candida w biegunce związanej z antybiotykami

Abstrakt

Aby ilościowo ocenić rolę gatunków Candida w biegunce związanej z antybiotykami (AAD), próbki kału od 395 pacjentów i osób z grupy kontrolnej wyhodowano na zróżnicowanym podłożu izolacyjnym: 98 pacjentów miało AAD, 93 pacjentów przyjmowało antybiotyki, ale nie miało biegunki (A+D-), 97 pacjentów nie przyjmowało antybiotyków, ale miało biegunkę (A-D+), a 107 pacjentów stanowiło grupę kontrolną (A-D-). Dodatkowo badano produkcję wydzielanej proteinazy aspartylowej (Sap). U pacjentów z AAD, Candida pozytywność (77/98) i Candida overgrowth (62/98) nie różniły się od tych wśród pacjentów A+D- (odpowiednio 75/93 i 52/93). Przerost Candida wśród pacjentów A-D+ (40/97, P=.003) był rzadszy niż wśród pacjentów AAD, ale Candida pozytywność nie różniła się (80/97, P=.612). U osób z grupy kontrolnej Candida pozytywna i przerośnięta występowała rzadziej niż we wszystkich pozostałych grupach. Wytwarzanie Sap nie różniło się między pacjentami z AAD i osobami z grupy kontrolnej (odpowiednio P=,568 i P=,590). Dane wskazują, że podwyższona liczba Candida jest raczej wynikiem leczenia antybiotykami lub biegunki niż przyczyną AAD

Drożdżyca jamy ustnej i zapalenie przełyku są najczęstszymi patologicznymi manifestacjami infekcji Candida. Rola Candida w biegunce związanej z antybiotykami (AAD) jest przedmiotem dyskusji. Uważa się, że stężenie Candida w kale wynoszące ⩾105 cfu/mL stolca może być przyczyną biegunki u pacjentów po antybiotykoterapii. Odnotowano, że pacjenci, którzy otrzymywali antybiotyki bez rozwoju biegunki, mieli <105 cfu grzybów Candida/mL stolca

Sekrecyjne proteinazy aspartylowe (Saps) są ważnymi czynnikami wirulencji wytwarzanymi przez gatunki Candida. Saps biorą udział w przyleganiu Candida albicans do błony śluzowej człowieka i w inwazji tkanek ludzkich. Korelacja pomiędzy ekspresją Sap a wirulencją Candida została wykazana w kandydozie jamy ustnej i Candida vaginitis u pacjentów zakażonych ludzkim wirusem niedoboru odporności (HIV). W AAD związanym z Candida, aktywne wydzielanie mediowane przez toksynę grzybiczą lub substancje toksynopodobne było dyskutowane jako mechanizm patogenetyczny biegunki. U C. albicans zidentyfikowano 10 różnych genów SAP. U Candida tropicalis zaobserwowano słabą zewnątrzkomórkową aktywność proteolityczną, podczas gdy Candida glabrata nie wykazuje aktywności proteolitycznej na agarze białkowym

C. albicans produkuje proteazy aspartylowe, gdy jest hodowany w podłożu z białkiem jako jedynym źródłem azotu, a ekspresja genu SAP2 jest zasadniczo odpowiedzialna za aktywność proteolityczną obserwowaną u większości szczepów rosnących w formie drożdży in vitro. Sapsy wykazują również aktywność proteolityczną w przewodzie pokarmowym; wykazano ekspresję SAP w kandydozie jamy ustnej i degradację mucyny przewodu pokarmowego przez Sapsy. Degradacja mucyny przewodu pokarmowego przez enzymy została uznana za czynnik determinujący wirulencję wielu enteropatogenów (np. Vibrio cholerae, Shigella species, Helicobacter pylori i Yersinia enterocolitica). W przypadku C. albicans, która kolonizuje powierzchnie błon śluzowych, degradacja mucyny przez SAP2 może umożliwić bliższe zbliżenie do komórek nabłonka i/lub modyfikację powierzchni komórkowych. Wyższe poziomy wydzielniczej proteazy kwasowej Candida stwierdzono u dzieci z ostrą i przewlekłą biegunką niż u zdrowych osób z grupy kontrolnej

Aby wyjaśnić znaczenie patogenetyczne gatunków Candida u dorosłych pacjentów z AAD, wykonaliśmy ilościowe posiewy stolca na gatunki Candida u 395 dorosłych osób z immunokompetencją. Ponadto zbadano produkcję Sapsa

Metody

Wybór pacjentów i pobieranie próbek stolcaWszyscy pacjenci na oddziale medycznym z 250 łóżkami byli badani pod kątem występowania biegunki lub leczenia antybiotykami w przypadku braku biegunki codziennie przez 11 miesięcy. Biegunka została zdefiniowana jako >3 mięsiste lub wodniste stolce na dzień . Leczenie antybiotykami zdefiniowano jako otrzymywanie doustnych lub dożylnych antybiotyków w dawkach terapeutycznych przez ⩾1 dzień. AAD zdefiniowano jako >3 muliste lub wodniste stolce na dobę w trakcie lub do 2 miesięcy po antybiotykoterapii. Pacjenci byli kolejno rekrutowani do 4 grup badawczych, aż do osiągnięcia wcześniej ustalonych liczb niezbędnych do porównania statystycznego (patrz analiza statystyczna poniżej). Pacjenci byli włączani do badania tylko raz w czasie pobytu w szpitalu

Próbki pobrane od wszystkich pacjentów z biegunką były hodowane w celu wykrycia patogenów bakteryjnych (salmonella, shigella, yersinia i campylobacter) na wybiórczym podłożu agarowym, badane pod kątem obecności komórek jajowych i pasożytów oraz testowane pod kątem obecności Clostridium difficile poprzez hodowlę na wybiórczym podłożu agarowym i przy użyciu szybkiego testu C. difficile (BD). Pacjenci z którymkolwiek z tych patogenów zostali wykluczeni z badania. W ten sposób do badania włączono 395 pacjentów (195 z biegunką i 200 bez), których przydzielono do 4 grup: (1) grupa A+D+, 98 pacjentów z AAD otrzymujących antybiotyki i doświadczających biegunki; (2) grupa A+D-, 93 pacjentów otrzymujących antybiotyki, ale nie doświadczających biegunki; (3) grupa A-D+, 97 pacjentów nie otrzymujących antybiotyków, ale doświadczających biegunki; i (4) grupa A-D-, 107 osób z grupy kontrolnej nie otrzymujących antybiotyków i nie doświadczających biegunki

Te 4 grupy nie różniły się pod względem płci i rozkładu wieku. Próbki stolca od wszystkich badanych pobierano bezpośrednio po wypróżnieniu i przynoszono do laboratorium w tym samym budynku w ciągu 15 minut. Próbki z kału oddanego w nocy przechowywano w temperaturze 4°C i przetwarzano następnego dnia rano

Hodowle Candida i wymazy ze szkiełek mikroskopowychPróbki kału rozcieńczano w stosunku 1:10 z solą fizjologiczną, mieszano w homogenizatorze kału i ponownie rozcieńczano w stosunku 1:1000 i 1:10000 z solą fizjologiczną. Sto mikrolitrów każdego rozcieńczenia przenoszono na płytkę Candida CHROMagar (BBL) i równomiernie posiewano za pomocą sterylnej wymazówki. Po inkubacji w temperaturze 37°C przez 48 h w otaczającym powietrzu kolonie Candida liczono i klasyfikowano jako C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis lub inne gatunki Candida, w zależności od koloru kolonii. Liczba kolonii ⩾105 cfu/mL stolca była klasyfikowana jako „przerost Candida”, według Danna et al. Wymaz ze szkiełka z każdego rozcieńczenia pierwszych 100 kolejnych próbek stolca barwiono barwnikiem Grama i badano pod mikroskopem świetlnym na obecność drożdżaków i leukocytów

Detection of SapsKolejne izolaty Candida z grup pacjentów A-D- i A+D+ badano pod kątem wydzielania proteinaz aspartylowych w agarze z surowiczą albuminą bydlęcą (BSA) (1,17% baza węglowa drożdży , 0,01% ekstrakt drożdżowy i 0,2% BSA ), jak opisano w innym miejscu . Podłoże zostało dostosowane do pH 5,0, wysterylizowane przez filtrację (wielkość porów 0,2 μm) i dodane do roztworu podstawowego autoklawowanego (2%) agaru. Proteolizę, wskazującą aktywność enzymu, mierzono w milimetrach i oceniano w sposób zaproponowany w innym miejscu: – lub ± (nie było widocznego lub bardzo ograniczone klarowanie agaru wokół kolonii), 1+ (obserwowano znaczną proteolizę) i 2+ (klarowanie agaru znacznie przekroczyło margines kolonii ). Szczep C. albicans SC5314 i mutant null SAP2 (dostarczony przez B. Hube, Uniwersytet w Hamburgu, Niemcy) były badane jako kontrole

Analiza statystycznaLiczbę pacjentów z różną liczbą Candida w różnych grupach porównano za pomocą testu χ2, a liczbę drożdżaków na rozmazach ze szkiełek laboratoryjnych skorelowano z liczbą Candida z hodowli za pomocą korelacji Pearsona. Różnice w produkcji Sap obliczano za pomocą testów t-Studenta i dokładnego Fishera. Wielkość próby do badania hodowli obliczono na 91 ocenianych pacjentów, a do badania SAP na 20 ocenianych pacjentów w każdej grupie, przy α równym .05 i mocy 0,8 (SigmaStat, wersja 2.0; Jandel Scientific). Różnice z P<.05 uznano za istotne

Wyniki

Kultury Candida i wymazy ze szkiełek mikroskopowychWyniki kultur Candida przedstawiono na rycinie 1. W grupie A+D+, Candida pozytywność (u 77/98 pacjentów) i Candida overgrowth (u 62/98 pacjentów) nie różniły się istotnie od tych w grupie A+D- (odpowiednio 75/93 pacjentów i 52/93 pacjentów). W grupie A-D+ przerost Candida występował istotnie rzadziej niż w grupie A+D+ (P=,003), natomiast Candida dodatni nie różnił się istotnie (P=,612). Pozytywność Candida i przerost Candida występowały istotnie rzadziej w grupie A-D- niż we wszystkich pozostałych grupach (Candida pozytywność: 66/107 pacjentów, P=,013, w porównaniu z grupą A+D+; P=,005, w porównaniu z grupą A+D-; i P=,002, w porównaniu z grupą A-D+; przerost Candida: 15/107 pacjentów, P<.001, w porównaniu z wszystkimi innymi grupami; rycina 1)

Analizy eksperymentalne wykorzystujące różne punkty odcięcia dla definicji przerostu Candida (103, 104, 106 lub 107 cfu/mL stolca) dały jakościowo podobne wyniki. We wszystkich obliczeniach przerost Candida występował istotnie rzadziej w grupie A-D- niż we wszystkich pozostałych grupach. Najczęściej izolowano C. albicans (216 z 395 pacjentów), a następnie C. glabrata (104 z 395 pacjentów), C. tropicalis (21 z 395 pacjentów), C. krusei (11 z 395 pacjentów) i inne gatunki Candida (97 z 395 pacjentów). Mieszane hodowle Candida stwierdzono u 122 (31%) z 395 pacjentów. Liczba drożdży w rozmazach ze szkiełek nie korelowała z liczbą drożdży w hodowlach (r=.27; rycina 2)

Wyniki aktywności proteolitycznej na agarze BSAOgółem, 23 izolaty A+D+ i 20 izolatów A-D-Candida badano pod kątem aktywności proteolitycznej na agarze BSA. Średnia±SD aktywności wynosiła 1,26±1,06 mm dla grupy A+D+ i 1,42±0,64 mm dla grupy A-D-. Spośród 23 izolatów A+D+, 16 miało wynik proteolizy 1+ (strefa klarowania 1-2 mm), a 1 miał wynik 2+ (strefa klarowania 3-5 mm), oba wskazujące na obecność aktywności enzymów proteolitycznych. Spośród 20 izolatów A-D-, 17 miało wynik proteolizy 1+, a 2 miały wynik 2+. Wszystkie izolaty C. albicans wykazywały strefy klarowania na podłożu BSA (⩾1 mm, wynik ⩾1+). W grupie A-D-, 1 izolat C. tropicalis nie wykazywał proteolizy. W grupie A+D+, 5 izolatów C. glabrata i 1 izolat C. tropicalis nie wykazywały proteolizy. Strefy klarowania w grupie A-D- i A+D+ nie różniły się istotnie ani w milimetrach (P=,568, test t-Studenta), ani przy zastosowaniu systemu punktacji 1+/2+ (P=,294 i P=,590 dla izolatów ocenionych odpowiednio na 1+ i 2+, dokładny test Fishera). Kiedy izolaty C. glabrata (które są znane jako negatywne na agarze białkowym) zostały usunięte, nie było znaczącej różnicy w produkcji Sap pomiędzy grupami (P=.347)

Dyskusja

Przerost Candida został postulowany jako przyczyna AAD . Zbadaliśmy obecność i ilość gatunków Candida u pacjentów podejrzanych o AAD, pacjentów bez biegunki ale przyjmujących antybiotyki, pacjentów z biegunką ale nie przyjmujących antybiotyków oraz pacjentów bez biegunki i nie przyjmujących antybiotyków (osoby z grupy kontrolnej). Znacznie większy odsetek próbek kału od pacjentów otrzymujących terapię antybiotykową i doświadczających biegunki (grupa A+D+) był pozytywny dla Candida species i miał wyższą liczbę kolonii niż próbki od osób z grupy kontrolnej (grupa A-D-). W badaniu przeprowadzonym przez Danna i wsp., przerost Candida (⩾105 cfu/mL stolca) zaobserwowano u 7 (29%) z 24 pacjentów z AAD. W tamtym badaniu 0 z 24 pacjentów bez biegunki, ale otrzymujących antybiotyki, miało przerost Candida. Jednak w naszym badaniu 52 (56%) z 93 pacjentów otrzymujących antybiotyki, ale bez biegunki, miało przerost Candida i nie zaobserwowano różnicy w porównaniu z pacjentami z AAD. Ponieważ badaliśmy prawie 4-krotnie większą liczbę pacjentów (93 vs. 24), różnice między naszymi wynikami a wynikami Danna i wsp. mogą wynikać z większej liczebności próby w naszym badaniu

Aby ocenić wpływ biegunki na liczbę Candida w jelitach, zbadaliśmy również pacjentów, którzy nie otrzymywali antybiotyków, ale mieli biegunkę (grupa A-D+). W tej grupie przerost Candida (⩾105 cfu/mL stolca) występował istotnie rzadziej niż u pacjentów z AAD, ale pozytywność Candida nie była istotnie różna. Wcześniejsze badania wykazały, że prawidłowa flora kału była znacznie obniżona u pacjentów z AAD. W badaniach, w których badano wpływ antybiotyków o szerokim spektrum działania na skład mikroflory jelitowej człowieka, zaobserwowano istotną odwrotną korelację pomiędzy log maksymalnego wzrostu liczby drożdżaków i log maksymalnego spadku liczby beztlenowców. Ponieważ stwierdziliśmy zwiększoną pozytywność Candida u pacjentów z AAD, A+D- i A-D+, sugerujemy, że spadek bakterii w stolcu, spowodowany albo antybiotykoterapią, albo rozcieńczeniem w biegunce, umożliwił ekspansję gatunków Candida, co spowodowało zwiększenie liczby pozytywnych Candida

W naszym badaniu średnia liczba drożdży na rozmazach barwionych barwnikiem Grama nie korelowała z hodowlami Candida, gdy obliczano ją albo z całkowitą liczbą drożdży na rozmazach (r=.27) lub wskaźnikiem zaproponowanym przez Dannę i wsp. (r=,12). Rozbieżność między dużą liczbą komórek drożdżopodobnych liczonych w mikroskopie świetlnym a słabym wzrostem lub brakiem wzrostu gatunków Candida została opisana w innym miejscu 15]. W tamtym badaniu autorzy przypuszczali, że znaczna większość drożdżaków w kale wykrytych pod mikroskopem nie była żywa. Nasze wyniki wskazują, że należy zachować dużą ostrożność w interpretacji próbek kału od pacjentów z AAD, w których stwierdzono obecność Candida species. Przydatność analizy kału pod kątem liczebności Candida za pomocą hodowli lub rozmazów slajdów u tych pacjentów jest poważnie kwestionowana. Brak leukocytów w próbkach barwionych metodą Grama był zgodny z wcześniejszymi ustaleniami. Nasze wyniki potwierdziły również, że gatunki Candida były częścią normalnej flory jelitowej

Aktywne wydzielanie mediowane przez toksynę grzybiczą lub substancje toksynopodobne zostało omówione jako mechanizm dla AAD związanego z Candida . Ponieważ SAP są głównymi czynnikami wirulencji w infekcjach Candida, zbadaliśmy te proteinazy w warunkach in vitro. Do tej pory zidentyfikowano 10 różnych genów SAP u C. albicans. Ponieważ stwierdzono, że SAP przyczynia się do uszkodzenia tkanek w modelu ludzkiej kandydozy jamy ustnej, proteinazy te mogą również uszkadzać komórki nabłonka jelitowego. Jednak u 8 pacjentów podejrzewanych o AAD związaną z Candida, nie było dowodów na zapalenie jelita grubego lub uszkodzenie komórek

W naszym badaniu, wszystkie badane szczepy C. albicans produkowały Soki, i nie było znaczącej różnicy między ilością Soku produkowanego w izolatach Candida od pacjentów z AAD i osób z grupy kontrolnej. U dzieci z ostrą i przewlekłą biegunką stwierdzono wyższe stężenie wydzielniczych proteinaz kwaśnych Candida niż u zdrowych osób z grupy kontrolnej. O ile poziomy Sap obliczone dla całej grupy dzieci z ostrą lub przewlekłą biegunką były istotnie wyższe niż u osób z grupy kontrolnej, o tyle nie dotyczyło to pojedynczych przypadków. Spośród 9 izolatów Candida, 4 pochodzące od osób z grupy kontrolnej (dzieci bez biegunki) miały poziom Sap porównywalny do dzieci z biegunką przewlekłą, a 2 z 9 osób z grupy kontrolnej miały poziom Sap porównywalny do dzieci z biegunką ostrą. Pomimo tak wysokich poziomów Sap, osoby z grupy kontrolnej nie miały biegunki. Jest to sprzeczne z wynikami poprzednich badań, w których produkcja Sap u chorych z objawami zawsze osiągała wyższy poziom niż u osób z grupy kontrolnej: Produkcja Sap przez Candida species od pacjentów z zapaleniem pochwy zawsze przekraczała produkcję Sap przez Candida od nosicieli, a szczepy Candida z kandydozy jamy ustnej u pacjentów z AIDS produkowały ∼8-krotnie więcej Sap niż izolaty od osób z grupy kontrolnej

Produkcja Sap jest spójnie wskazywana przez test agarowy BSA i ELISA . Ponadto, wysoki poziom Sap wydzielanego in vitro i wykrywanego przez BSA agar lub ELISA korelował z podwyższonym poziomem Sap in vivo (np. w płynach pochwowych od pacjentów z zapaleniem pochwy będących nosicielami HIV). Można spekulować, że Candida species przejściowo wytwarza wysoki poziom Sap in vivo, ale traci tę zdolność np. z powodu subkulturowania. U C. albicans wyizolowanych z jamy ustnej wykazano, że podwyższona produkcja Sap jest cechą stabilną. Z drugiej strony, izolaty C. albicans o niskiej produkcji proteinaz wykazywały stabilną, niską produkcję Sap przy wielokrotnych podhodowlach

Podsumowując, wyniki naszych badań nie potwierdzają wcześniej sugerowanych mechanizmów patogenetycznych AAD związanych z Candida. Nasze dane wskazują, że podwyższone liczby Candida są raczej wynikiem leczenia antybiotykami lub biegunki per se niż przyczyną AAD. Produkcja głównego czynnika wirulencji grzyba Sap u pacjentów z AAD nie różniła się od tej u osób z grupy kontrolnej, co wskazuje, że ta toksyna grzyba może nie być odpowiedzialna za AAD u dorosłych. Inne czynniki wirulencji grzybów (np. phospholipases) warrant further investigation