Zakażenie Bartonella: Treatment and Drug Resistance

Antybiotykoterapia Bartonellozy

Leczenie zakażeń Bartonella za pomocą antybiotyków zależy od obrazu klinicznego choroby i statusu immunologicznego pacjenta, dlatego aktualne zalecenia dotyczące leczenia muszą być dostosowane do każdej sytuacji klinicznej.

Techniki badania wrażliwości na antybiotyki

Metoda rozcieńczeń agarowych Do badania wrażliwości izolatów Bartonella na antybiotyki in vitro stosowana jest metoda rozcieńczeń agarowych, opisana wcześniej przez Maurina i wsp. Szczepy Bartonella hodowano na agarze Columbia z dodatkiem 5% krwi owczej. Hodowle dodatkowo uzupełniano dwukrotnymi seryjnymi rozcieńczeniami antybiotyku. Komórki pobierano po 5 dniach inkubacji i zawieszano w buforze fosforanowym (pH 7,4). Do oznaczeń antybiotyków używano dziesięciokrotnie rozcieńczonych zawiesin bakteryjnych o stężeniu odpowiadającym standardowi McFarlanda 0,5; stężenie to odpowiada około 106 jednostkom tworzącym kolonie/ml, jak określono przy użyciu techniki jednostek tworzących kolonie. Łącznie 10µl każdej zawiesiny bakteryjnej zostało posiane na agar z dodatkiem krwi. Płytki inkubowano w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2. Wzrost bakterii oceniano po 5 dniach inkubacji przez porównanie ze wzrostem na kontrolnych płytkach agarowych bez antybiotyków. Wartość minimalnego stężenia hamującego (MIC) zdefiniowano jako pierwsze stężenie antybiotyku pozwalające na zahamowanie wzrostu po 5 dniach inkubacji.

Etest Assay Etest assay jest od niedawna stosowany do oceny wrażliwości na antybiotyki u Bartonella. Gradient antybiotyku pokrywa stabilny, ciągły i wykładniczy gradient stężenia antybiotyku bezpośrednio pod paskiem. Po inkubacji, gdy wzrost bakterii staje się widoczny, widoczna jest symetryczna elipsa inhibicji skupiona wzdłuż paska. MIC (w µg/ml) jest odczytywany bezpośrednio ze skali w miejscu przecięcia krawędzi elipsy z paskiem. Izolaty Bartonella są hodowane na płytkach agarowych z 5% krwi owczej Columbia, a badanie wrażliwości na antybiotyki wszystkich izolatów Bartonella jest przeprowadzane przy użyciu dostępnych pasków Etest dla różnych antybiotyków, zgodnie z zaleceniami producenta. MIC jest mierzony po inkubacji trwającej 5-12 dni (Rycina 1). We wcześniejszym badaniu wykazano, że wyniki MIC uzyskane przy użyciu Etestu były wiarygodne i dobrze korelowały z wynikami uzyskanymi metodą rozcieńczeń agarowych.

Wyniki wrażliwości na antybiotyki

Na podstawie badań in vitro, gatunki Bartonella są wrażliwe na wiele antybiotyków, w tym penicyliny i inne związki oparte na cefalosporynach, (np, aminoglikozydy, chloramfenikol, tetracykliny, związki makrolidowe, rifampina, fluorochinolony i ko-trimoksazol). Jednak wyniki wrażliwości in vitro nie zawsze korelują z danymi dotyczącymi pacjentów in vivo; na przykład penicylina nie wykazuje skuteczności in vivo pomimo bardzo niskich MIC obserwowanych in vitro. Badania wrażliwości na podłożu agarowym wykazały również, że wiele antybiotyków jest jedynie bakteriostatycznych wobec gatunków Bartonella in vitro. Poprzednie badania wykazały, że in vitro aminoglikozydy są jedyną klasą antybiotyków, które są bakteriobójcze w stosunku do gatunków Bartonella hodowanych zarówno w podłożu płynnym, jak i w komórkach śródbłonka.

Mechanizmy oporności na antybiotyki u Bartonella

Główne mechanizmy działania środków przeciwbakteryjnych to zakłócanie syntezy kwasów nukleinowych, wiązanie się z rybosomem oraz hamowanie syntezy ściany komórkowej i metabolizmu folianów. Bakterie mogą rozwinąć oporność na antybiotyki w wyniku dwóch procesów genetycznych. Pierwszy to mutacja i selekcja (pionowy transfer genów), a drugi to wymiana genów między szczepami i gatunkami (poziomy transfer genów). W przypadku bakterii wewnątrzkomórkowych, w tym gatunków Bartonella, oporność na antybiotyki wynika głównie z mutacji spontanicznych lub mutacji wewnętrznych w genach docelowych (tj. pionowy transfer genów), które zostały omówione w dalszej części artykułu. Jednakże ostatnio po raz pierwszy wykazaliśmy możliwość bocznego transferu genów plazmidu koniugacyjnego pomiędzy Bartonella rattaustraliani i innymi bakteriami, w tym B. henselae lub rizobiales. Może to sugerować, że geny oporności na antybiotyki mogą być przenoszone bocznie i że powinno to być przedmiotem dalszych badań w przyszłości.

Naturalna oporność na antybiotyki Heterogenność wrażliwości 20 nowych izolatów Bartonella na fluorochinolony wyizolowanych od australijskich ssaków była ostatnio badana w jednym z naszych badań. W tym badaniu stwierdziliśmy, że ciprofloksacyna była bardziej skuteczna in vitro niż ofloksacyna. Ta heterogenność była związana z naturalną mutacją, Ser 83→Ala, w regionie determinującym oporność na chinolony (QRDR) genu gyrA. Co ciekawe, analiza genomu in silico ujawniła naturalną mutację w pozycji 83 regionu QRDR (Ser 83→Ala) gyrA występującą u trzech gatunków Bartonella (B. bacilliformis, B. quintana i B. henselae). Wiele badań wykazało, że gatunki naturalnie posiadające resztę serynową w pozycji 83 gyrA są zwykle wrażliwe na fluorochinolony, podczas gdy obecność alaniny w tej krytycznej pozycji zwykle odpowiada naturalnej oporności na te antybiotyki.

Podobnie, przejście A2059G w genie kodującym 23S rRNA odpowiedzialnym za oporność na erytromycynę wykryto w jednym z 15 węzłów chłonnych od pacjentów z CSD. Węzeł ten został wycięty od 10-letniej kobiety, która nie była leczona antybiotykami przed wycięciem, co sugeruje, że naturalnie występujące szczepy oporne na erytromycynę mogą zakażać ludzi.

Oporność na antybiotyki in vitro Ostatnio scharakteryzowano specyficzne mutacje oporności na antybiotyki u B. henselae, B. quintana i B. bacilliformis, wyselekcjonowane przez seryjne pasażowanie in vitro (Tabela 1).

W gatunkach Bartonella, w badaniach in vitro opisano różne mechanizmy oporności na erytromycynę (Figura 2A). Wcześniej wykazaliśmy, że w pełni oporny na erytromycynę szczep B. quintana uzyskany po 16 pasażu in vitro posiadał powtórzoną insercję 27 zasad w białku rybosomalnym L4, co skutkowało wstawieniem dziewięciu powtórzonych aminokwasów pomiędzy aminokwasami R71 i A72 w wysoce konserwatywnym regionie białka. Ostatnio opisaliśmy kilka mutacji w genie kodującym 23S rRNA i białko rybosomalne L4 w szczepie B. henselae Marseille oraz w innych mutantach B. henselae opornych na erytromycynę in vitro. Większość mutacji w genie kodującym 23S rRNA (np. A2058G, A2058C i C2611T) została wcześniej wykazana jako nadająca oporność na erytromycynę u innych bakterii. Znaleźliśmy mutacje aminokwasowe w dwóch różnych pozycjach (G71R i H75Y) w białku rybosomalnym L4 w mutantach B. henselae opornych na erytromycynę. Mutacja A2058G w opornym na erytromycynę szczepie B. bacilliformis została również opisana przez nasz zespół. W nowszych badaniach wykazano, że azytromycyna była skuteczna tylko do drugiego pasażu w przypadku izolatów B. henselae uzyskanych od kotów. W porównaniu ze szczepem rodzicielskim, każdy mutant B. henselae oporny na azytromycynę posiadał jednorodną pojedynczą substytucję nukleotydową w pozycji 2058 (A2058G, numeracja Escherichia coli) w genie kodującym 23S rRNA.

Wyselekcjonowaliśmy również szczep B. henselae in vitro oporny na gentamycynę. Gen 16S rRNA-encoding, gen kandydujący do oporności na gentamycynę (Figura 2A), został scharakteryzowany za pomocą analizy sekwencji. Oporny na gentamycynę mutant B. henselae nosił mutację A1408G w genie kodującym 16S rRNA, co obrazuje podwójny pik A/G. Ponadto mutacja ta jest najbardziej rozpowszechniona wśród genów kodujących gentamycynę. Ponadto, mutacja ta jest najczęściej spotykaną mutacją w klinicznych izolatach opornych na gentamycynę u innych gatunków bakterii. Chociaż uzyskaliśmy mutanta opornego na gentamycynę in vitro, mutant ten został uzyskany po dziewięciu pasażach (18 tygodni), co sugeruje, że selekcja takich szczepów opornych na gentamycynę nie jest prawdopodobna in vivo.

Fluorochinolony są szeroko stosowane w leczeniu zakażeń Bartonella u ludzi i w medycynie weterynaryjnej. Jednakże, same fluorochinolony nie powinny być stosowane w leczeniu bartonellozy, ponieważ istnieje nieodłączny niski poziom oporności spowodowany mutacją gyrA. Ponadto, wysoki poziom oporności na fluorochinolony można łatwo uzyskać in vitro. Zmiana enzymów docelowych wydaje się być najbardziej dominującym czynnikiem w rozwoju oporności na chinolony (Rysunek 2B). Mały region od kodonów 67-106 gyrA w E. coli został oznaczony jako QRDR. Wariacje w regionie QRDR znaleziono u gatunków z naturalną opornością na fluorochinolony. W 2003 roku Minnick i wsp. wyizolowali i scharakteryzowali mutanty B. bacilliformis oporne na ciprofloksacynę. W 2007 r. uzyskaliśmy in vitro szczep B. bacilliformis oporny na ciprofloksacynę; szczep ten zawierał przejście z C na T w pozycji 549 (numeracja E. coli) genu gyrA, kodującego przewidywaną zmianę aminokwasową Asp 87→Asn w gyrA. Ta sama mutacja (Asp 87→Asn) została również niedawno znaleziona w szczepach B. henselae i B. quintana opornych na ciprofloksacynę (Tabela 1).

W innym badaniu wykazano, że izolaty B. henselae uzyskane od kotów stały się oporne na pradofloksacynę i enrofloksacynę (oba są fluorochinolonami stosowanymi głównie w medycynie weterynaryjnej) po różnej liczbie pasaży. W porównaniu z macierzystymi szczepami B. henselae, mutanty oporne na pradofloksacynę i enrofloksacynę posiadały zmianę aminokwasu z seryny na walinę w pozycji 83 (numeracja E. coli) w gyrA. Mutacja Ser 83→Val znaleziona w mutantach opornych na pradofloksacynę i enrofloksacynę w tym badaniu została zgłoszona wcześniej przez Tavío i wsp. w izolacie E. coli opornym na fluorochinolony.

Wreszcie, substytucje aminokwasowe w polimerazie RNA i mutacje punktowe w genie rpoB zostały wykazane po selekcji in vitro opornych na ryfampinę (Figura 2B) szczepów B. bacilliformis i B. quintana przez naszą grupę. Szczepy te wykazywały mutację przy serynie 531 (Ser→Phe) w regionie determinującym oporność na rifampinę genu rpoB. Aminokwas 531 jest jednym z najczęściej mutowanych miejsc nadających oporność na ryfampinę u innych gatunków bakterii (Tabela 1).

Leczenie bartonellozy u zwierząt

Żaden antybiotyk nie okazał się w pełni skuteczny w zwalczaniu zakażeń Bartonella u kotów i psów. W poprzednich badaniach przeprowadzonych przez Kordick i wsp. doksycyklina i enrofloksacyna okazały się skuteczne w zwalczaniu zakażeń Bartonella u kotów. W badaniu tym podawano doustnie 22,7 mg enrofloksacyny co 12 h oraz 25 mg doksycykliny co 12 h; czas trwania leczenia wynosił 14-28 dni. Bakteriemia u naturalnie zarażonych kotów z przewlekłym zakażeniem została skutecznie usunięta u dziewięciu z 14 kotów leczonych enrofloksacyną i tylko u dwóch z ośmiu kotów leczonych doksycykliną. Co ciekawe, azytromycyna, związek z grupy makrolidów o dobrej penetracji wewnątrzkomórkowej, stała się lekiem z wyboru w leczeniu zakażeń B. henselae u kotów i psów. Jednakże, również w przypadku tego leczenia odnotowano nawroty choroby po odstawieniu antybiotyków. W leczeniu kotów można stosować doksycyklinę i enrofloksacynę, a w leczeniu psów fluorochinolony z doksycykliną lub azytromycyną. Jednakże, ponieważ przebadano wiele różnych schematów leczenia, trudno jest wyciągnąć jakiekolwiek wnioski dotyczące skuteczności fluorochinolonów stosowanych pojedynczo lub w połączeniu. Wreszcie, leczenie kotów przeciwko pchłom jest również kluczowe dla uniknięcia przenoszenia pasożytów na ludzi.

Leczenie Bartonellozy u ludzi

Zalecenia dotyczące leczenia zakażeń wywołanych przez gatunki Bartonella są opisane w Tabeli 2. Najczęściej zalecanymi antybiotykami stosowanymi w leczeniu zakażeń Bartonella u ludzi są doksycyklina i erytromycyna, jednakże odnotowano poprawę kliniczną po zastosowaniu penicyliny, gentamycyny, ceftriaksonu, cyprofloksacyny i azytromycyny.

Choroba kociego pazura zwykle nie odpowiada dobrze na antybiotykoterapię. W licznych doniesieniach oceniano skuteczność wielu leków przeciwbakteryjnych w leczeniu typowego, niepowikłanego CSD. Większość badaczy nie zaobserwowała korzyści z leczenia antybiotykami, natomiast niepotwierdzone doniesienia wskazują na skuteczność ciprofloksacyny, rifampiny i kotrimoksazolu. W prospektywnym, randomizowanym, podwójnie zaślepionym, kontrolowanym placebo badaniu dotyczącym antybiotykoterapii CSD u ludzi, przeprowadzonym przez Bassa i wsp. azytromycyna podawana doustnie przez 5 dni została uznana za skuteczną w zmniejszaniu rozmiarów węzłów chłonnych w ciągu pierwszych 4 tygodni terapii. Jednak u niektórych uczestników badania pomimo leczenia azytromycyną dochodziło do powiększenia różnych węzłów chłonnych lub zwiększenia rozmiarów pierwotnego węzła chłonnego.

W typowym CSD nie zaleca się leczenia antybiotykami, nawet jeśli azytromycyna może być przydatna u pacjentów z dużym i rozległym powiększeniem węzłów chłonnych. W przypadku nietypowej postaci CSD antybiotykoterapia jest konieczna, a połączenie doksycykliny i rifampiny zaproponowano w przypadku zapalenia siatkówki i encefalopatii.

Podczas I wojny światowej żołnierze cierpiący na gorączkę okopową przechodzili infekcję bez leczenia antybiotykami. Jednak po II wojnie światowej donoszono o skutecznym leczeniu niektórych pacjentów z gorączką okopową za pomocą tetracykliny lub chloramfenikolu, choć dane te pozostają niepotwierdzone. W randomizowanym badaniu klinicznym przeprowadzonym przez Foucault i wsp. wykazano, że osoby bezdomne z epizodami bakteriemii wywołanej przez B. quintana powinny być leczone kombinacją gentamycyny i doksycykliny. Wyniki wykazały eradykację bakteriemii u siedmiu z dziewięciu leczonych pacjentów w porównaniu do dwóch z 11 nieleczonych pacjentów z grupy kontrolnej. Pacjenci z ostrą bakteriemią B. quintana mogą być leczeni gentamycyną w połączeniu z doksycykliną przez 28 dni.

Terapia Bartonella endocarditis jest krytyczna, ponieważ odsetek zgonów i operacji zastawek jest wyższy u tych pacjentów. Raoult i wsp. wykazały, że odsetek wyleczeń pacjentów był wyższy, gdy aminoglikozydy były stosowane w połączeniu z β-laktamem lub innymi antybiotykami. Dlatego też zaleceniem dla pacjentów z Bartonella endocarditis jest doksycyklina przez 6 tygodni plus gentamycyna przez 14 dni.

Angiomatoza brodawkowata i PH powinny być leczone erytromycyną przez 3-4 miesiące jako antybiotyk pierwszego rzutu. Chociaż erytromycyna ma działanie antybiotykowe przeciwko Bartonella, wykazano, że erytromycyna ma również działanie antyangiogenne na komórki śródbłonka, co może przyczyniać się do jej dobrej aktywności in vivo. Jako alternatywę można zastosować doksycyklinę. Czas trwania leczenia erytromycyną jest krytyczny (3 miesiące w przypadku angiomatosis bacillary i 4 miesiące w przypadku PH) w celu ograniczenia nawrotów.

Penicylina G, chloramfenikol, tetracyklina, streptomycyna i erytromycyna były stosowane w leczeniu gorączki Oroya, która jest wywoływana przez B. bacilliformis. Fluorochinolony były z powodzeniem stosowane w leczeniu gorączki Oroya, ale nie zalecamy ich stosowania samodzielnie, ponieważ w rodzaju Bartonella występuje samoistny niski poziom oporności na fluorochinolony z powodu wewnętrznej mutacji w gyrazie DNA. Jako leczenie alternatywne można zastosować chloramfenikol sam lub w połączeniu z β-laktamem lub ciprofloksacyną.

Od 1975 roku rifampina stała się lekiem z wyboru w leczeniu verruga peruana. Jednakże, odnotowano również niepowodzenia w leczeniu rifampiną, co może być spowodowane opornymi szczepami, które są łatwe do uzyskania in vitro. W jednym z naszych ostatnich badań zaleciliśmy doksycyklinę w połączeniu z gentamycyną jako preferowany schemat leczenia przewlekłej fazy choroby Carriona.