Biologia celular@Yale

Conteúdo da palestra

Membrana de organelas

Células eucarióticas contêm coleções de proteínas que funcionam como uma unidade chamada organelas. Algumas destas organelas são circundadas por uma membrana de estrutura semelhante à membrana celular, mas com uma composição diferente de proteínas e fosfolípidos.

Membranas-organelas-ligadas oferecem várias vantagens às células eucarióticas. Em primeiro lugar, as células podem concentrar e isolar enzimas e reagentes em um volume menor, aumentando assim a taxa e eficiência das reações químicas. Em segundo lugar, as células podem confinar proteínas e moléculas potencialmente nocivas em organelas ligadas à membrana, protegendo o resto das células dos seus efeitos nocivos. Por exemplo, o lisossoma, que é uma organela ligada a membranas, contém muitas enzimas que digerem proteínas, ácidos nucleicos e lipídios. Se essas enzimas fossem liberadas no citosol, elas poderiam mastigar as proteínas, ácidos nucléicos e lipídios da célula, levando à morte da célula. A membrana que envolve o lisossoma mantém essas enzimas digestivas longe do resto da célula.

Microtubulo Organização do Citoplasma

Organelas e proteínas geralmente não são distribuídas aleatoriamente por toda a célula, mas são organizadas pela localização das mesmas em regiões onde são necessárias. A célula utiliza microtubulos e proteínas motoras para ajudar a localizar as organelas. As microtubulas são filamentos longos que se estendem ao longo do citoplasma. Dois tipos de proteínas motoras, cinesinas e tinturas, caminham ao longo dos microtubos e geram força para puxar organelas através do citoplasma.

Microtubos são polímeros de um heterodímero de alfa e beta tubullin. A tubulina polimeriza em protofilamentos lineares e um microtubo contém 13 protofilamentos dispostos em um cilindro com um núcleo oco. Os microtúbulos são polarizados em uma extremidade menos e mais. As microtubulas crescem a partir das suas extremidades mais, adicionando mais subunidades de tubulina. As extremidades menos dos microtubulos são instáveis e são estabilizadas por proteínas no centro de organização dos microtubulos (MTOC). Se o MTOC está no centro de uma célula, os microtubos irradiam para fora com suas extremidades mais em direção à membrana plasmática

Cininas e tinturas caminham ao longo dos microtubos utilizando a energia da hidrólise de ATP. Ambos os conjuntos de proteínas contêm domínios motores que ligam os microtubos e hidrolisam ATP. Os domínios motores geram movimento ao longo dos microtúbulos. A maioria dos cinesineses caminha em direção à extremidade mais dos microtubos, enquanto que a dynein caminha em direção à extremidade menos. Isto dá às células duas ferramentas para controlar a distribuição de organelas ao longo dos microtubos. As cinesinas e as tinturas também contêm um domínio de ligação de carga que as liga a diferentes organelas. As cinesinas são uma grande família de proteínas e o domínio de ligação da carga é o mais divergente, permitindo que diferentes membros da família das cinesinas liguem diferentes organelas. A dinina é um grande complexo de várias proteínas e a forma como liga a carga é menos clara.

filamentos de actina também suportam o transporte de material celular, mas em distâncias muito mais curtas do que os microtubos. Os filamentos de actina são um polímero de actina que é uma pequena proteína globular. O filamento de actina é uma matriz helicoidal de actina e semelhante aos microtubos tem uma extremidade mais e menos com os filamentos crescendo mais rapidamente a partir de suas extremidades mais. Os filamentos de actina não têm os contactos laterais extensos dos microtubos e normalmente são muito mais curtos do que os microtubos. Filamentos de actina tendem a se localizar perto da membrana celular onde eles fornecem suporte estrutural.

Miosinas são uma classe de proteínas motoras que podem gerar força ao longo dos filamentos de actina. Algumas miosinas estão envolvidas na contração celular (ou seja, contração muscular), enquanto outras suportam o movimento e posicionamento das organelas. As miosinas da classe V estão envolvidas no transporte de organelas em vários tipos diferentes de células. Semelhante à estrutura da cinesina, as miosinas classe V contêm um domínio motor que liga os filamentos de actina e utiliza a energia da hidrólise de ATP para caminhar ao longo dos filamentos. O termo C da miosina V liga organelas.

Para transportar e posicionar organelas, as células usam frequentemente microtubos e filamentos de actina. Microtubos, cinesinas e tinturas são usados para mover organelas em longas distâncias (vários microns ou mais), enquanto filamentos de actina transportam organelas em curtas distâncias (por exemplo, perto da membrana plasmática). Muitas vezes uma organela contém mais de um tipo de proteína motora (por exemplo, cinesina e miosina V) para permitir que as células utilizem ambos os conjuntos de filamentos para posicionar a organela.

Sequências de Sinais

Para manter a identidade e função das diferentes organelas e membrana plasmática, as células precisam direcionar proteínas específicas para organelas e outros compartimentos intracelulares. A maioria destas proteínas contém uma sequência curta, chamada sequência de sinal, que determina a sua localização intracelular. As sequências de sinal podem ser localizadas em qualquer parte de uma proteína, mas são frequentemente encontradas no N-terminus. Seqüências de sinal que visam proteínas para a mesma organela frequentemente não compartilham a mesma seqüência primária. Normalmente são as propriedades bioquímicas gerais da sequência que determinam se ela visa uma proteína para uma organela. Seqüências de sinais são usadas para importar tanto proteínas solúveis quanto proteínas de membrana integral.

Importar proteínas para organelas ligadas à membrana

Porque as membranas que envolvem as organelas restringem a passagem das proteínas, as organelas evoluíram diferentes mecanismos para importar proteínas do citoplasma. A maioria das organelas contém um conjunto de proteínas de membrana que formam um poro. Este poro permite a passagem de proteínas com a sequência de sinal correcta. Alguns poros (ER, mitocôndria) só podem acomodar proteínas desdobradas, enquanto outros poros (núcleo, peroxisoma) permitem a passagem de proteínas dobradas.

Proteínas alvo para o retículo endoplásmico

Proteínas destinadas à secreção, a membrana plasmática ou qualquer organela da via secretora são primeiro inseridas no ER. A maioria das proteínas atravessa as ER co-traduzindo-as, sendo sintetizadas por ribossomos nas ER. Tanto as proteínas solúveis (proteínas que residem no lúmen das organelas ou que são secretadas) como as proteínas da membrana integral são direccionadas para o ER e translocadas pelo mesmo mecanismo.

A sequência de sinal para as proteínas do ER geralmente reside no N-terminus. A partícula de reconhecimento de sinal (SRP), um complexo de 6 proteínas e um RNA, liga a sequência de sinal imediatamente após a sua tradução. A SRP também interage com o ribossomo e pára a tradução. A superfície das membranas do ER contém um receptor para SRP. O receptor SRP recruta SRP, a proteína nascente do ER e o ribossomo para o ER. O receptor SRP libera o SRP da sequência do sinal e permite que a tradução continue na membrana do ER.

Ribossomos na membrana do ER ligam-se ao translocador de proteínas. O translocador é uma proteína transmembrana que forma um poro aquoso. O poro é o canal através do qual as proteínas do ER recentemente sintetizadas serão translocadas através da membrana do ER. A translocação da proteína ER gera a “força” para empurrar a proteína ER através do canal.

Proteínas solúveis são completamente translocadas através do canal; a sequência de sinal permanece no canal e é clivada do resto da proteína por uma protease no lúmen da ER.

Proteínas da membrana íntegral contêm uma sequência de transferência de paragem a jusante da sequência de sinal. A sequência de transferência stop cessa a translocação através do canal e a porção da proteína após a sequência de transferência stop reside fora do ER. As proteínas integrais da membrana podem ser translocadas de forma que o seu N-terminus ou C-terminus residam no lúmen do ER. As proteínas com seu términus C no lúmen tendem a ter uma sequência de sinal interna. O translocador parece abrir-se de um lado para permitir que as proteínas da membrana integral se difundam no bocal lipídico circundante.

algumas proteínas atravessam a membrana várias vezes e estas proteínas contêm, após a sequência de transferência stop, uma sequência de transferência inicial que reinicia a translocação da proteína através do canal. Uma proteína com uma sequência de sinal, parar a transferência e iniciar a transferência atravessaria a membrana duas vezes com um laço residente no citosol ou lúmen. Para gerar proteínas que atravessam a membrana várias vezes, a proteína precisaria de várias seqüências de parada e transferência estelar alternadas.

Proteínas ONCE entram no ER, elas dobram em suas estruturas tridimensionais. Existem vários mecanismos para ajudar a dobrar as proteínas, incluindo as chaperones e a glicosilação. O ER também contém mecanismos para lidar com proteínas que não conseguem dobrar.

Proteínas alvo para Mitocôndrias

Embora as mitocôndrias contenham seu próprio genoma, a maioria das proteínas mitocondriais são codificadas por genes nucleares, necessitando de um mecanismo para alvejar e importar essas proteínas para as mitocôndrias. Semelhante às proteínas importadas para as ER, as proteínas mitocondriais contêm uma sequência de sinal que as direcciona para as mitocôndrias. Ao contrário das proteínas do ER, as proteínas mitocondriais são importadas pós-tradução. Como as proteínas devem ser desdobradas para translocar através de canais na membrana mitocondrial, as proteínas mitocondriais são mantidas desdobradas no citosol por chaperones.

A importação de proteínas para mitocôndrias é semelhante à importação para o RE, mas é complicada pela presença de duas membranas ao redor das mitocôndrias. As proteínas mitocondriais podem residir na membrana externa, membrana interna, espaço intermembrana, ou matriz (espaço dentro da membrana interna). Assim, as mitocôndrias possuem translocadores que permitem a passagem de proteínas através da membrana externa e através da membrana interna. O complexo TOM mede a passagem através da membrana externa enquanto que o complexo TIM mede a passagem através da membrana interna.

Translocação de proteínas em Mitocôndrias

A sequência de sinal que tem como alvo as proteínas para a matriz geralmente reside no N-terminus. A sequência de sinal é reconhecida pelas proteínas no complexo TOM. O complexo TOM passa as proteínas para o espaço da membrana interna, onde o complexo TIM na membrana interna passa as proteínas para a matriz. O complexo TOM e TIM frequentemente trabalham juntos para translocar uma proteína através de ambas as membranas. A translocação através das membranas mitocondriais é dependente da energia. As conchas dentro da matriz ajudam a “puxar” a proteína através da membrana interna e requerem hidrólise de ATP para funcionar. As proteínas dobram dentro da matriz.

Proteínas direcionadas para a membrana interna usam um mecanismo similar às proteínas da matriz, mas contêm uma seqüência de transferência de parada reconhecida pelo complexo TIM. As proteínas direcionadas para a membrana externa são translocadas através da membrana externa para o espaço intermembrana e depois importadas para a membrana externa pelo translocador SAM. As proteínas direcionadas para o espaço intermembrana são parcialmente inseridas na membrana interna e então clivadas por uma protease e liberadas no espaço da membrana interna.

Importação e Exportação de Proteínas Nucleares

Em contraste com as ER e mitocôndrias, o núcleo importa principalmente proteínas solúveis. Além disso, as proteínas frequentemente são transportadas entre o núcleo e o citoplasma e a célula utiliza a importação/exportação nuclear para regular várias vias bioquímicas críticas. O núcleo é rodeado por duas membranas e embutido nestas membranas estão milhares de poros nucleares através dos quais proteínas e outras macromoléculas (RNA, ribsossomos) entram e saem do núcleo. Os poros nucleares são estabilizados nas membranas por laminas, uma rede citoesquelética que está por baixo da membrana nuclear interna e fornece suporte estrutural à membrana. O poro nuclear restringe a passagem do material com base no tamanho: coisas menores que ~ 30 kD difundem-se livremente através do poro, mas moléculas grandes precisam de uma maneira de entrar e sair. As proteínas que entram no núcleo contêm um sinal de importação nuclear e as que devem também sair do núcleo contêm uma seqüência de exportação nuclear.

Distinguindo o Citoplasma do Nucleoplasma

Para gerar transporte dirigido de proteínas para dentro e para fora do núcleo, as proteínas devem saber se estão no citoplasma ou dentro do núcleo. Para diferenciar o núcleo do citoplasma, as células utilizam uma pequena proteína de ligação ao GTP chamada Ran. Como todas as proteínas ligantes ao GTP, Ran existe tanto no estado ligado ao GTP como no estado ligado ao PIB. Duas proteínas catalisam a mudança entre estes estados. Ran-GAP (proteína ativadora de GTPase) catalisa a hidrólise de GTP gerando Ran-GDP. Ran-GEF (fator de troca de nucleotídeos da guanina) catalisa a liberação do PIB e a rebobinagem do GTP, gerando Ran-GTP. Ran-GAP localiza-se no lado citoplasmático dos poros nucleares enquanto Ran-GEF associa-se com a cromatina e, portanto, localiza-se no núcleo. Como resultado, a maioria Ran no núcleo é ligada ao GTP e a maioria Ran no citoplasma é ligada ao GDP.

Importação Nuclear

Receptores (importins) ligam seqüências de importação nuclear em proteínas. As importinas também interagem com filamentos que se estendem para fora do lado citoplasmático dos poros nucleares. Por um mecanismo desconhecido, as importinas ligam-se ao seu tráfego de carga através do poro nuclear. Dentro do poro, o complexo de importação de carga encontra o Ran-GTP. Ran-GTP dissocia as importações da carga, liberando proteínas da carga para fazer seu trabalho no núcleo.

Nuclear Export

Muitas proteínas que entram no núcleo devem ser exportadas para o citoplasma (por exemplo, as importações). Estas proteínas contêm uma sequência de exportação nuclear que interage com um receptor chamado exportin. Ran-GTP liga-se a este complexo de exportação de carga e estabiliza a interação. O complexo exportin-cargo-RanGTP trafica através do poro (mecanismo não claro) onde encontra Ran-GAP no lado citoplasmático. Ran-GAP converte Ran-GTP para Ran-GDP fazendo com que a exportina se dissocie de sua carga.

Importando proteínas em peroxisomas e Síndrome de Zelleweger

Peroxisomas são pequenas organelas (~ 1 µm de diâmetro) que desempenham uma variedade de funções para as células. Os peroxissomas metabolizam produtos químicos nocivos (fenóis, formaldeído, etanol), metabolizam ácidos gordos, e catalisam uma etapa na síntese de plasmalogéneo que é um lipídio encontrado na mielina.

Proteínas alvo de peroxissomas contêm uma sequência de sinal que é reconhecida por uma família de proteínas chamada proteínas Pex. Algumas destas proteínas Pex ligam-se para sinalizar sequências enquanto outras para um poro na membrana dos peroxisomas que permite a entrada de proteínas peroxisómicas.

Células que contêm mutações nas proteínas Pex não podem importar proteínas para os peroxisomas e consequentemente, estas células carecem de peroxisomas. As mutações nas proteínas Pex estão associadas a um conjunto de doenças chamado Síndrome de Zelleweger. Na síndrome de Zelleweger, os bebês não têm tônus muscular e muitas vezes a capacidade de amamentar. Os bebês também apresentam anormalidades craniofaciais e um fígado aumentado. O prognóstico para bebês que sofrem da Síndrome de Zelleweger é pobre, com a maioria não sobrevivendo além de um ano.

Porque os peroxissomas contribuem para a síntese de um lipídio encontrado na mielina, os pacientes com Zelleweger’s frequentemente exibem mielinização pobre dos neurônios. A mielinização é crítica para a função dos neurônios na condução de sinais para as células-alvo.