O aumento a longo prazo da massa e força muscular esquelética através da administração de um único gene de inibidores de miostatina
Resultados e Discussão
A entrega do gene mediado por AV ao músculo fornece um sistema para gerar altos níveis de proteína no tecido alvo ou por um produto secretado transportado para locais remotos através da circulação (19). Clonamos os conhecidos genes inibidores da miostatina secretada, incluindo a proteína-1 (GASP-1) (18), o gene relacionado à follistatina (FLRG) (17) e a follistatina-344 (FS) (13) no sorotipo 1 do AAV, que demonstraram elevadas capacidades de transdução muscular. Existem duas isoformas de follistatina geradas por emendas alternativas. A variante FS-344 sofre uma clivagem peptídeo para gerar a isoforma FS-315 e a outra variante FS-317 produz a isoforma FS-288 após a clivagem peptídeo. Utilizamos a variante humana FS-344, que gera exclusivamente a isoforma FS-315 circulante do FS e inclui uma região ácida terminal C (20). Escolhemos a FS-344 (FS), porque a outra isoforma FS-317, sem o termo C, mostra localização preferencial para o fluido folicular ovariano e alta afinidade de ligação dos tecidos através de proteoglicanos de sulfato de heparina, o que pode afetar a capacidade reprodutiva e ligar-se a outros locais fora do alvo (21). O FS-288 representa a forma de follistatina ligada à membrana (22), é um potente supressor do hormônio estimulador do folículo pituitário (23), é encontrado no líquido folicular do ovário e nos testículos, e demonstra uma alta afinidade pelas células granulosas do ovário.
Procuramos determinar a eficácia dessas proteínas para aumentar a massa muscular em ratos normais e distróficos. Administramos 1 × 1011 partículas virais AAV1 por animal codificando FS, FLRG, GASP-1, ou GFP bilateralmente nos músculos quadríceps e tibialis anteriores de camundongos C57BL/6 tipo selvagem de 4 semanas. Todos os animais tratados com os inibidores de miostatina demonstraram um aumento da massa corporal com um notável aumento bruto dos músculos quando analisados aos 725 dias de idade em comparação com os controles tratados com GFP (Fig. 1 a e b). A avaliação dos pesos musculares individuais mostrou um aumento da massa muscular em todos os animais tratados com inibidores de miostatina, com o maior aumento nos animais tratados com FS. O aumento da massa muscular foi encontrado nos músculos dos membros inferiores injetados e nos músculos remotos para o local da injeção, como os tríceps. Assim, esses inibidores foram secretados na circulação a partir do local da injeção muscular, aumentando a massa muscular esquelética em locais remotos (Fig. 1 c). O aumento da massa muscular foi acompanhado de melhora funcional demonstrada por um aumento da força de preensão dos membros inferiores (Fig. 1 d). Não houve efeito sobre a massa cardíaca ou aparência histológica dos cardiomiócitos, indicando que a inibição da miostatina foi seletiva ao tecido muscular esquelético (dados não mostrados). Tem havido preocupação de que o FS afeta negativamente a função gonadal. Não encontramos alteração na capacidade reprodutiva em camundongos tratados com nosso AAV1 portadores do transgene FS344 (AAV1-FS, Tabela 1) Além disso, não encontramos alterações histológicas/patológicas no tecido gonadal de camundongos tratados com FS em comparação com controles (dados não mostrados).
As proteínas inibidoras da miostática aumentam a massa muscular e a força em ratos do tipo selvagem C57BL/6. (a) A massa muscular bruta dos membros inferiores é aumentada em todos os ratos tratados com miostático-inibidor-proteína aos 725 dias de idade, em comparação com os controles injetados com AAV1-GFP. (b) A massa corporal total é significativamente aumentada em ratos com AAV1-FS injetados (**, P ≤ 0.01) e controles com AAV1-GASP-1 injetados (*, P ≤ 0.05) em comparação com controles com AAV1-GFP aos 725 dias de idade (n = 10). (c) A massa dos músculos dos membros inferiores e membros dianteiros individuais é aumentada em camundongos injetados com AAV expressando proteínas inibidoras de miostatina (n = 10). *, P ≤ 0.05. (d) A força de aderência dos membros inferiores melhora >2 anos em todos os ratos tratados com as maiores diferenças nos animais tratados com AAV1-FS em comparação com os controles AAV1-GFP (n = 10). As barras de erro representam o erro padrão.
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A produção foi normal em animais tratados com AAV1-FS
Dados os efeitos robustos da entrega de FS, testamos em seguida o potencial de entrega de AAV1-FS pós-natal em um paradigma clinicamente significativo para aumentar a massa e força muscular e retardar a deterioração muscular no modelo de rato mdx da distrofia muscular de Duchenne (DMD). A DMD é uma doença recessiva ligada ao X que resulta no desperdício de músculos esqueléticos e da função cardíaca, resultando em última instância em morte. Recentemente, a FS foi investigada em animais mdx, expressando em excesso um domínio duplicado do gene follistatina. Os resultados demonstraram aumento de massa muscular e patologia atenuada, embora os resultados só tenham sido documentados até as 15 semanas de idade (24). Em nossos estudos, animais mdx foram injetados bilateralmente nos músculos quadríceps e tibialis anteriores com uma dose baixa (1 × 1010 partículas virais) ou alta (1 × 1011 partículas virais) de AAV1-FS com 3 semanas de idade e seguidos por 5 meses antes da necropsia. Foram detectados níveis aumentados de FS circulantes no soro de animais tratados em dose baixa e alta com a dose alta expressando os maiores níveis de FS detectados (dose alta, 15,3 ± 2,1 ng/ml; dose baixa, 6,8 ± 0,4 ng/ml; controles de GFP, 0 ± 0,1 ng/ml; n = 8 por grupo; P < 0,01). Demonstramos que a AAV1-FS aumentou a massa corporal em relação aos controles tratados com GFP, com o maior aumento no grupo de alta dose de FS (dados não mostrados). A observação bruta de ratos tratados com AAV1-FS mostrou um aumento significativo no tamanho muscular comparado com animais tratados com AAV1-GFP (Fig. 2 a), com o maior aumento de peso muscular individual em animais tratados com FS de alta dose (Fig. 2 b). Os efeitos não foram restritos aos músculos injetados; eles também foram encontrados em locais distantes dos músculos diretamente visados (Fig. 2 b). O aumento da massa muscular traduziu-se numa melhoria da força muscular dependente da dose nos membros posteriores e nos membros anteriores dos animais tratados em comparação com os controles tratados com GFP (Fig. 2 c). Análises histológicas e morfométricas dos músculos injetados de AAV1-FS e em locais remotos demonstraram hipertrofia de miofibras, suportando observações brutas feitas no momento da necropsia (Fig. 3 a-c). Além disso, não houve mudança nos tipos de fibras musculares em animais tratados com AAV-FS; entretanto, havia menos fibras totais por milímetro quadrado de área no músculo tibial anterior em animais tratados com a alta dose de AAV-FS (Fig. 3 d e e). De forma impressionante, os ratos tratados com FS demonstraram uma redução significativa na creatina-quinase sérica em comparação com os controles tratados com GFP (Fig. 4 a). Isso é de interesse, pois o FS era protetor apesar de não corrigir a deficiência de distrofina subjacente. O mecanismo exato não é claro, mas pode-se especular que o aumento da resistência das fibras individuais as torna menos suscetíveis a danos devido ao estresse das atividades normais. O envolvimento de células satélites na inibição da miostatina pós-natal ainda não foi totalmente resolvido; entretanto, não vimos uma mudança estatística nos marcadores de células satélites musculares para animais tratados com FS (dados não mostrados).
Injeção única de AAV1-FS aumenta a massa muscular e a força em ratos mdx jovens. (a) A massa muscular bruta dos membros posteriores é aumentada em animais mdx injetados com AAV1-FS aos 180 dias de idade em comparação com os controles injetados com AAV1-GFP. (b) A massa muscular dos membros posteriores e membros anteriores individuais é aumentada aos 180 dias de idade em camundongos injetados com AAV1-FS aos 3 semanas de idade, em comparação com os controles AAV1-GFP (n = 15). *, P ≤ 0.05. (c) A força de aderência é melhorada de maneira dose-dependente em ratos jovens mdx injetados às 3 semanas de idade com AAV1-FS seguido por 180 dias (n = 15). Vermelho, dose alta AAV1-FS; azul, dose baixa AAV1-FS; verde, controles AAV1-GFP. As barras de erro representam os erros padrão.
ratos mdx tratados com AAV1-FS com 3 semanas de idade e seguidos durante 180 dias demonstram hipertrofia de miofibra. (a) H&E a coloração da tibialis anterior revela hipertrofia da miofibra no músculo injetado com AAV1-FS comparado ao controle de AAV1-GFP. (Ampliação original, ×40.) (b) O diâmetro médio das miofibras escuras (oxidante de engate lento), intermediárias (glicolítico oxidante de engate rápido) e claras (glicolítico de engate rápido) na tíbia anterior (indicado pela linha hachurada) é significativamente aumentado em camundongos injetados com AAV1-FS em comparação com controles injetados com AAV1-GFP. (P < 0,001; n = 5). (c) O diâmetro médio das miofibras intermediárias e leves (indicado pela linha hachurada) no tríceps é significativamente aumentado em ratos injetados com AAV1-FS em comparação com controles injetados com AAV1-GFP. (P < 0,001; n = 5.) (d) A distribuição de fibras escuras, intermediárias e claras como determinada pela coloração succinética de desidrogenase (SDH) não é alterada pelo tratamento com doses altas ou baixas de AAV1-FS. (P > 0,05 entre todos os grupos; n = 5.) (e) O número médio de fibras contadas por uma armação de contagem imparcial de 0,14 mm2 é diminuído na tibialis anterior dos ratos tratados com AAV1-FS, dado que o diâmetro médio das miofibras é aumentado. (*, P < 0,01; n = 5.) As barras de erro representam erros padrão.
ratos mdx tratados com AAV1-FS mostram marcadores diminuídos de dano muscular e ratos mdx envelhecidos são responsivos ao tratamento FS com benefício funcional. (a) Os níveis de creatina cinase sérica (unidades/litro) são reduzidos aos 3 meses após a injeção com AAV1-FS em comparação com controles injetados com AAV1-GFP. (*, P < 0.05; n = 10.) As barras de erro representam erros padrão. (b) A força de aderência da trepa é significativamente aumentada (P ≤ 0,05) aos 275 dias e mais em ratos mdx idosos tratados com AAV1-FS aos 210 dias de idade (n = 15). Vermelho, alta dose de AAV1-FS; verde, controles AAV1-GFP. (c) H&E de gastrocnêmio idoso demonstra patologia reduzida quando injetado aos 210 dias de idade com FS em comparação com controles injetados com GFP. (Ampliação original, ×40.) (d) H&E do diafragma dos animais injetados aos 210 dias de idade com FS mostra menos reposição de gordura do que os controles injetados com GFP no estágio tardio. (Ampliação original, ×20.)
Também avaliamos o potencial de AAV1-FS para aumentar a força muscular em animais mdx quando tratados em idade mais avançada. Verificamos que a injeção de AAV1-FS aos 210 dias de idade aumentou a força muscular ≈60 dias após a administração e que o aumento da força persistiu a longo prazo durante os 560 dias avaliados neste estudo (Fig. 4 b). Logo aos 180 dias de idade, antes do tratamento com AAV1-FS, havia patologia evidente na musculatura de animais mdx não tratados, com proeminente proliferação de tecido conjuntivo endomísio e inflamação (Fig. 4 c e d). A avaliação patológica dos músculos gastrocnêmio e diafragmático aos 560 dias de idade demonstrou que os animais tratados com AAV1-FS tinham substancialmente menos grupos focais de fibras musculares necróticas e infiltrados de células mononucleares. É importante ressaltar que os animais tratados com AAV1-FS apresentaram redução significativa das áreas focais de proliferação de tecido conjuntivo endomísio, que foram pronunciadas nos animais tratados com GFP, demonstrando que a fibrose, uma marca registrada da distrofia muscular, foi diminuída nos animais tratados com FS (Fig. 4 c). A patologia no diafragma também mostrou que o tratamento com FS reduziu a inflamação e a reposição de gordura em comparação com animais tratados com GFP (Fig. 4 d). Além disso, o tratamento com AAV1-FS demonstrou aumentos significativos no diâmetro das fibras musculares nesta idade, em comparação com animais tratados com GFP de controle (Fig. 4 c e d). Esses resultados demonstraram que a inibição da miostatina pelo tratamento com FS foi benéfica em animais mdx envelhecidos que haviam sofrido múltiplas rondas de degeneração e regeneração muscular. A tradução para um paralelo clínico sugere que a terapia genética com FS mediada por AAV poderia ter potencial para o paciente idoso com DMD independente da substituição do gene ausente e poderia ter um papel potencial na terapia combinada semelhante à demonstrada para a substituição do gene IGF-1 e minidistrofina (25).
Estes resultados sugerem que a inibição da miostatina por FS-344, administrada por uma única injeção de AAV1 pode aumentar o tamanho e a força muscular e é bem tolerada para >2-anos. Os resultados do FS-344 podem oferecer uma estratégia mais poderosa do que outras visando apenas a miostatina devido aos efeitos aditivos, como o envolvimento da follistatina em múltiplas vias de sinalização, e a recente descoberta demonstrando uma redução na inflamação em um modelo de endotoxemia (15, 26). A capacidade marcante do FS de proporcionar melhora grosseira e funcional a longo prazo dos músculos distróficos em animais idosos justifica sua consideração pelo desenvolvimento clínico para tratar doenças músculo-esqueléticas, incluindo pacientes DMD mais velhos.