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Esta palestra é baseada em uma revisão recente.

A crescente carga da diabetes no mundo inteiro é bem conhecida, e os efeitos nos custos dos cuidados de saúde e no sofrimento humano, morbidade e mortalidade serão sentidos principalmente nas nações em desenvolvimento, incluindo Índia, China e países na África. Novos medicamentos estão sendo desenvolvidos em um ritmo acelerado, e nos últimos anos têm sido observadas várias novas classes de compostos para o tratamento do diabetes, por exemplo, peptídeo tipo glucagon (GLP-1), inibidores de dipeptidise-4 (DPP-4), inibidores do transporte de glicose de sódio-2 (SGLT2). Novos tratamentos cirúrgicos também têm se tornado cada vez mais disponíveis e defendidos como terapias eficazes para a diabetes. Cirurgia de restrição gástrica, cirurgia de bypass gástrico, transplante simultâneo de pâncreas e rim, transplante pancreático e de ilhotas foram todos introduzidos nos últimos anos. Para evitar o trauma de uma grande operação, tem havido muitos estudos sobre o transplante de ilhotas isoladas removidas de um pâncreas cadavérico. O “protocolo Edmonton” descrito por Shapiro e colegas no New England Journal, em 2000, foi encorajado. As ilhotas foram injetadas na veia porta e pacientes, especialmente aqueles que sofriam de desconhecimento perigoso e hipoglicêmico, foram tratados antes de terem desenvolvido complicações graves de diabetes, especialmente complicações renais. Embora os resultados iniciais fossem promissores, com cerca de 70% dos pacientes sem necessidade de injeções de insulina após dois anos, aos cinco anos, a maioria desses pacientes havia se deteriorado e necessitou de suplementos de insulina, apesar de alguns terem recebido mais de um transplante de ilhotas. Na série mais recente de pacientes, o grupo Edmonton relatou melhores resultados a longo prazo com o uso do anticorpo monoclonal anti linfócito, Campath 1H administrado como agente indutor, 45% dos pacientes eram insulino-independentes aos cinco anos e 75% tinham peptídeo C detectável.

No entanto, o pâncreas cadavárico e as ilhotas competem pela mesma fonte e são em número limitado, e assim, nenhum dos tratamentos pôde ser oferecido prontamente à grande maioria dos pacientes diabéticos. Alguns tentaram utilizar uma fonte alternativa, por exemplo, ilhotas encapsuladas de porcos neonatais ou adultos. Isto ainda é muito experimental e será uma alternativa distante com muitos obstáculos técnicos e possivelmente éticos a ultrapassar.

Mais recentemente, com o sucesso no desenvolvimento de células estaminais pluripotentes adultas (da Yamanaka, galardoada com o Prémio Nobel da Medicina de 2012 pelo desenvolvimento de células estaminais pluripotentes induzidas – iPSC), foram tentadas novas abordagens para procurar um método que possa ser mais acessível e disponível. Muita esperança foi derivada inicialmente da pesquisa com células-tronco embrionárias (ESC), pois estas células podem ser persuadidas a se multiplicar e se desenvolver em qualquer tecido, mas o processo foi caro e o problema da formação de teratoma a partir destas células-tronco provou ser extremamente difícil de superar. Muitos dos factores importantes relacionados com o desenvolvimento fetal não são compreendidos e não podem ser reproduzidos. No entanto, alguns progressos foram feitos, e (ocasionalmente) as células foram persuadidas a secretar insulina, mas até agora tem havido uma aplicação terapêutica muito mínima.

Os cientistas estão agora conscientes de que persuadir uma célula a produzir insulina é apenas um passo no que pode ser uma longa e difícil jornada. As células das ilhotas são altamente especializadas para ter não só uma liberação basal de insulina, mas também para responder rapidamente às mudanças na concentração de glicose no sangue. Com a insulina, o processo e a regulação do desligamento da secreção é tão importante como o ligar da secreção.

Foi feita uma variedade de abordagens com diferentes pontos de partida. A célula estaminal reproduz-se a si própria e pode então também dividir-se assimetricamente e formar outro tipo de célula: Isto é conhecido como diferenciação. Embora inicialmente se pensasse que estavam disponíveis apenas a partir de embriões, as células estaminais não-embrionárias podem agora ser obtidas sem muita dificuldade a partir de tecido neonatal, cordão umbilical e também de uma variedade de tecidos adultos, incluindo medula óssea, pele e gordura. Estas células estaminais podem ser expandidas e diferenciadas, mas o seu repertório é restrito em comparação com as células estaminais embrionárias: oligo- ou pluri- em oposição às células estaminais embrionárias toti-potentes. Ainda mais recentemente, tem havido muito interesse no processo de trans-diferenciação celular direta, no qual uma célula comprometida e totalmente diferenciada, por exemplo uma célula hepática, é mudada diretamente para outro tipo de célula, por exemplo uma beta-célula de ilhotas, sem indução de desdiferenciação de volta ao estágio de células-tronco.

Yamanaka, em 2006, foi capaz de produzir células-tronco pluripotentes a partir de culturas de fibroblastos neonatais e adultos de camundongos, adicionando um coquetel de quatro fatores definidos. Isto levou a uma série de outros estudos que desenvolveram o processo, o qual demonstrou ser repetível com tecido humano, bem como com ratos de laboratório. O uso de células iPS evitou as restrições éticas do uso de embriões humanos, mas ainda houve outros problemas e obstáculos. Tem havido relatos emergentes de células iPS tornando-se antigênicas para um hospedeiro autólogo ou isólogo, e as células podem acumular anormalidades de DNA e até reter a memória epigenética do tipo celular de origem e, portanto, ter tendência a reverter. Como as células estaminais embrionárias, as células iPS podem formar teratoma, especialmente se a diferenciação não for completa.

Apesar disso, tem havido muito pouco sucesso em direcionar a diferenciação de iPSC para formar células beta de ilhotas em quantidade suficiente que irão secretar e parar a secreção em resposta às mudanças nos níveis de glicose no sangue.

Outra abordagem que tem sido tentada é combinar a terapia genética com células-tronco. Alguns progressos têm sido feitos na tentativa de expressar o gene da insulina desejado em células indiferenciadas mais primitivas através da coaxação das células estaminais com factores de diferenciação in vitro e depois através da transfecção directa do gene usando plasmídeos ou um vector viral. Nós, e outros, temos utilizado uma construção do gene da insulina humana e introduzimos ex vivo ou in vivo nas células por eletroporação direta (em células ex vivo obviamente) ou por vetores virais. Os adenovírus, vírus adeno-associados e vários retrovírus têm sido mais estudados, especialmente o lentivírus. No entanto, qualquer tipo de engenharia genética suscita receios não só de infecção pelo vírus, mas também de desmascaramento de onco-genes, levando à malignidade, e existem regulamentos rigorosos sobre como proceder para evitar estes riscos.

Estamos interessados nas células estaminais do cordão umbilical e nas células estaminais mesenquimais como alvos para a terapia combinada de células estaminais e genes. Estas células podem ser obtidas de uma forma razoavelmente fácil e reprodutível a partir do cordão umbilical descartado, ou da medula óssea de fácil acesso, seleccionando as células utilizando várias técnicas padrão. A gordura, o âmnio e o sangue do cordão umbilical também são fontes, das quais podem ser derivadas células estaminais mesquíficas. Após uma fase proliferativa, as células assumem uma aparência semelhante a um tapete de fibroblastos, que pode diferenciar-se em células ósseas, cartilagens ou gordurosas. Embora as células estaminais mesenquimais das várias fontes mencionadas possam parecer semelhantes, os seus potenciais de diferenciação são idiossincráticos e diferentes, o que torna inapropriado e difícil pensar nelas como uma fonte uniforme de células-alvo. As células amniónicas neonatais e as células do cordão umbilical têm baixa imunogenicidade e não expressam antigénios HLA classe II. Também secretam factores que inibem as reacções imunitárias, por exemplo, o HLA-G solúvel. Embora a imunogenicidade seja reduzida significativamente, eles ainda não são autólogos e, portanto, ainda há um risco de rejeição de aloenxertos. Eles têm a vantagem de poderem ser multiplicados, congelados e depositados em grandes quantidades e podem ser usados em pacientes que já necessitam de agentes imunossupressores, por exemplo, aqueles com transplantes renais.

Em Singapura, os nossos estudos de células amniônicas derivadas do cordão umbilical têm mostrado algum sucesso em ter expressão de insulina e genes glucagon, mas pouca ou nenhuma secreção de insulina in vitro. Juntamente com a transfecção do gene da insulina in vitro, após o transplante peritoneal em ratos diabéticos induzidos por esterptozotocina, houve alguma melhora nos níveis de glicose. Nossos colegas em Singapura utilizaram outro modelo de hepatócitos autólogos de porcos diabéticos induzidos por estreptozotocina. Estes hepatócitos separados foram transfectados ex-vivo com sucesso com um gene de insulina humana construído por electroforese, e depois as células foram injectadas directamente de volta ao parênquima hepático usando múltiplas injecções separadas. Os porcos foram curados da sua diabetes por até nove meses – o que é um feito notável. Como se tratava de autotransplantes, não foram necessárias drogas imunossupressoras, mas as células hepáticas foram obtidas a partir de grandes biópsias cirúrgicas abertas. Esta necessidade de remoção cirúrgica do tecido hepático limitaria a sua aplicabilidade, mas no entanto tem sido uma boa prova de estudo conceptual. No contexto da diabetes auto-imune, o risco de doença recorrente pode muito bem persistir, a menos que o alvo do ataque auto-imune possa ser definido e eliminado. Nessas experiências com suínos, foi utilizado o gene da insulina humana com um promotor de detecção de glicose EGR-1. Não havia vírus envolvido, e o plasmídeo não se integra. A divisão da célula transfectada diluiria a atividade do gene, mas um grande número de plasmídeos pode ser produzido a baixo custo. O mesmo grupo de trabalhadores transfectou com sucesso células estaminais mesenquimais da medula óssea com o plasmídeo do gene da insulina humana usando o mesmo promotor EGR-1 e electroforese. Este camundongo diabético curado após injeção direta intra-hepática e intra-peritoneal.

Finalmente, deve haver cautela na interpretação dos resultados destes e de outros relatos de terapia celular e genética para diabetes. In gene transfection and/or transplantation of insulin-producing cells or clusters in the diabetic rodent, there have been many reports in the literature, but only a few of these claims have been reproduced in independent laboratories. We have suggested the need to satisfy “The Seven Pillars of Credibility” as essential criteria in the evaluation of claims of success in the use of stem cell and/or gene therapy for diabetes.

1. Cure of hyperglycemia

2. Response to glucose tolerance test

3. Evidence of appropriate C-peptide secretion

4. Weight gain

5. Prompt return of diabetes when the transfecting gene and/or insulin producing cells are removed

6. No islet regeneration of stereptozotocin-treated animals and no re-generation of pancreas in pancreatectomized animals

7. Presence of insulin storage granules in the treated cells