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Discussão

Este estudo mostra, pela primeira vez, que o consumo a longo prazo de DE, individualmente ou em combinação com etanol, causa alterações bioquímicas e ultraestruturais nos músculos do coração.

Nossos resultados revelaram que tanto o Red Bull quanto o etanol aumentaram as concentrações de glicose e glicogênio no miocárdio. No grupo RB, o aumento das concentrações de glicose e glicogênio foi causado por dois ingredientes de DE, cafeína e taurina. Normalmente, a cafeína causa liberação de cálcio das reservas intracitoplasmáticas (22) e ativa a AMPK via cálcio/ proteína quinase-β (CaMKKK) dependente de calmodulin (23). A AMPK promove a captação e o uso de glicose nos cardiomiócitos (24). Além disso, o AMPK inibe a síntese de glicogênio através da fosforilação da glicogênio sintetase ou ativa a degradação do glicogênio através da fosforilação da glicogênio fosforilase (25). Entretanto, a ativação crônica da AMPK, como provavelmente aconteceu em nosso estudo, pode aumentar a síntese do glicogênio aumentando a absorção de glicose e a formação de glucose-6-fosfato. Isto induz a ativação alostérica da glicogênio sintetase que pode superar a fosforilação inibitória pela AMPK (26). Além disso, tem sido relatado que a taurina aumenta a absorção de glicose, glicólise e síntese de glicogênio no coração de ratos adultos (27).

Em nosso estudo, o etanol levou a um leve aumento nas concentrações de glicose e glicogênio. O etanol diminui a sensibilidade à insulina, que é mediada no músculo cardíaco pelo fator de necrose tumoral-α (TNFα) e/ou interleucina-6 (IL-6), induzindo a ativação das quinases terminais de Jun N, que inibe a via de sinalização Akt-AS160-GLUT4 (28). Como tal, a concentração de glicose deveria ter diminuído. Não podemos fornecer uma explicação desses resultados, e não há nenhum estudo sobre esse tópico na literatura. Entretanto, as modificações ultraestruturais mostradas na Figura 4 nos levaram a considerar que o ciclo de Krebs não estava funcionando corretamente e, consequentemente, o metabolismo da glicose no miocárdio foi afetado.

A administração combinada de Red Bull e etanol produziu um aumento significativo na concentração de glicose, o que era esperado porque a administração independente de cada um desses componentes aumentou a concentração de glicose no miocárdio.

O glicogênio é uma molécula vital para o funcionamento normal do miocárdio. É necessária para o desenvolvimento ontogenético do coração, pois fornece a energia necessária para o crescimento e desenvolvimento do órgão (29). No órgão maduro, o glicogênio é encontrado em pequenas quantidades, fornecendo energia para o sistema excito-condutor. Uma grande quantidade de glicogênio só é benéfica em condições isquêmicas (30). O acúmulo de glicogênio no miocárdio favorece a incidência da síndrome pré-excitação (31). Vários estudos relataram associação dos DE e/ou álcool com a ocorrência de efeitos negativos a nível cardiovascular (palpitações, arritmias cardíacas, hipertensão e até morte súbita cardíaca) (2,32); portanto, não podemos excluir a possibilidade desses efeitos estarem ligados ao acúmulo de glicogênio no miocárdio.

Concentração de colesterol significativamente diminuída em todos os grupos. Este efeito pode, por sua vez, ser uma causa das disfunções miocárdicas relatadas no consumo crônico de DE e álcool. Um papel do colesterol é o de endurecer as membranas celulares e manter a forma das células, formando “pontes” (jangadas lipídicas) nas regiões onde as proteínas da membrana são expressas (33). Além disso, o colesterol controla a fluidez da membrana e, consequentemente, tem um papel importante na relação colesterol/fosfolipídeo (34). A razão molar entre colesterol e fosfolipídios nas membranas plasmáticas é geralmente mantida logo abaixo da unidade (35). Portanto, a redução da concentração de colesterol pode levar à desestabilização da membrana, que por sua vez pode afetar o metabolismo celular no miocárdio.

A diminuição da concentração de colesterol induzida pela Red Bull pode ter sido devido ao elevado conteúdo de taurina e/ou niacina presente na DE. Esta alteração é um pouco esperada porque tanto a taurina como a niacina são utilizadas na prevenção e cura da aterosclerose (36, 37). Mais precisamente, a taurina reduz o colesterol sérico (38) e a niacina reduz o colesterol sérico e os triglicerídeos e aumenta a concentração de HDL (39).

Colesterol diminuído no miocárdio após tratamento com etanol crônico também foi relatado por Godfrey et al. (40) e Hu et al. (41), mas ninguém jamais explicou esses resultados e o significado fisiológico do fenômeno é desconhecido.

A administração combinada de Red Bull e etanol induziu uma redução ainda maior do colesterol no miocárdio do que a administração independente dos dois componentes.

Nossos resultados mostram um leve aumento na concentração da proteína miocárdica em todos os grupos tratados, sendo significativo no grupo E. O ligeiro aumento na concentração protéica observado após a administração de Red Bull pode ser devido ao alto conteúdo de vitamina B6. Uma dose de Red Bull vendida na Romênia contém 250% da dose diária recomendada de B6. A vitamina B6 é um cofactor essencial no funcionamento de mais de 140 enzimas necessárias para a síntese, degradação e interconversão de aminoácidos (42).

A formação de adutos proteicos poderia ser uma explicação para o aumento significativo na concentração de proteína no grupo E observado no nosso estudo. Pesquisas demonstraram que o álcool causa o acúmulo de adutos protéicos nos tecidos hepáticos, nervosos e musculares, agravando a toxicidade induzida pelo etanol nesses tecidos (43). Em um estudo de Worrall et al. (44), quantidades aumentadas de aductos proteicos de acetaldeído reduzidos, acetaldeído não reduzido e malondialdeído-acetaldeído foram encontradas no tecido cardíaco de ratos após 6 semanas de tratamento com álcool. Além disso, um estudo prévio mostrou que os adutos formados por acetaldeído com proteínas estimulam a formação de mRNA responsável pela síntese de colágeno e expressão das proteínas do tecido conjuntivo (45).

AST e ALT atividades aumentaram no miocárdio e diminuíram no soro após todos os tratamentos. De acordo com as alterações ultra-estruturais causadas pela Red Bull e pelo etanol, as atividades destes marcadores de integridade de membrana deveriam ser aumentadas no soro. Entretanto, nossos resultados são consistentes com os de Mihailovic et al. (46), que relataram um aumento na atividade AST com atividade ALT inalterada no músculo cardíaco após um tratamento de 10 dias com etanol. Nossos resultados mostram que Red Bull teve os mesmos efeitos prejudiciais que o etanol, pelo menos no músculo cardíaco. Além disso, a combinação de Red Bull e etanol teve efeitos sinérgicos e/ou complementares na atividade da AST.

As alterações ultraestruturais mais graves observadas no tecido cardíaco de ratos tratados com etanol (Fig. 4c e 4d)4d) são aquelas que indicam o início da cardiomiopatia alcoólica. Conforme apontado por De Leiris et al. (47), sujeitos humanos e modelos animais expostos ao consumo crônico de etanol sofrem alterações funcionais e estruturais no tecido cardíaco. O estresse oxidativo induz peroxidação lipídica, oxidação proteica, reduz o conteúdo de GSH das mitocôndrias e perturba a homeostase do cálcio, prejudicando a capacidade contrátil do músculo cardíaco. As organelas também apresentam estruturas modificadas com cristae desorganizada, resultando em alteração do metabolismo oxidativo. Um excelente trabalho de Tsiplenkova et al. (48) fornece um inventário detalhado dos danos causados pelo etanol na cardiomiopatia alcoólica, como a alteração das membranas mitocondriais, incluindo o inchaço das organelas e a perda de cristae. Esses autores também notaram um aumento no número de mitocôndrias com miocôndrias, em que o espaço ocupado pelas mitocôndrias era maior do que o ocupado pelas miofibrilas. Isto é consistente com a nossa observação de espaços intermiofibrilar aumentados preenchidos com mitocôndrias. Curiosamente, também observamos que a população de mitocôndrias subarcolemélias estava reduzida, enquanto numerosas áreas de lise estavam presentes.

Além disso, observamos depósitos de colágeno no espaço intercelular, o que também foi relatado por Urbano-Marquez e Fernandez-Sola (49) em pacientes humanos com cardiomiopatia alcoólica.

Se essa alteração cardiomiócitos pode terminar em apoptose ou necrose permanece pouco clara; entretanto, a apoptose, ou mesmo uma combinação de apoptose e necrose, parece produzir perda de miócitos na cardiomiopatia alcoólica (50).

Embora as alterações cardiomiócitas induzidas pelo consumo de álcool estejam bem documentadas, há muito poucas evidências, se alguma, sobre alterações ultraestruturais induzidas por DE no músculo cardíaco. Em alguns miócitos do grupo RB, o arranjo miofibril mostrou uma estrutura solta e o espaço entre eles foi ocupado por várias mitocôndrias grandes (inchadas) exibindo uma matriz rarefeita e cristae dilatada, o que levou à suposição de que o metabolismo oxidativo foi afetado. Todas essas alterações morfológicas se correlacionaram com alterações bioquímicas medidas nas concentrações de glicose, glicogênio e colesterol e atividades AST e ALT relatadas em nosso estudo. A proliferação exagerada de mitocôndrias (“mitocondriose”) no meio de miofibrilas estreitas também foi relatada por Tsiplenkova et al. (48), como uma característica da cardiomiopatia alcoólica.

Nos miócitos do grupo RBE, os efeitos acumulados de DE e etanol foram ainda mais dramáticos, com aumento das áreas de lise, maioria das miofibrilas sem um arranjo regular (paralelo), miofibrilas com uma parte delas fragmentada e várias mitocôndrias com estruturas rarefeitas e cristae dilatada. Numerosas vesículas estavam presentes nos espaços intermiofibrilares, provavelmente preenchidas com glicogênio, como já foi relatado anteriormente (49) na cardiomiopatia alcoólica. Essas alterações estruturais também suportam as alterações bioquímicas medidas em nosso estudo. Vários miócitos tinham núcleos hipocrómicos com bordas irregulares, e os discos intercalados estavam fragmentados e deiscentes.