Role of Candida in Antibiotic-Associated Diarrhea

Abstract

Para avaliar quantitativamente o papel das espécies de Candida na diarréia associada a antibióticos (DAA), amostras de fezes de um total de 395 pacientes e indivíduos controle foram cultivados em meio de isolamento diferencial: 98 pacientes tinham DAA, 93 pacientes estavam tomando antibióticos mas não tinham diarréia (A+D-), 97 pacientes não estavam tomando antibióticos mas tinham diarréia (A-D+), e 107 pacientes eram indivíduos controle (A-D-). Além disso, foi testada a produção de proteinase de aspartílo secretado (seiva). Em pacientes com DAA, a positividade de Candida (77/98) e o crescimento excessivo de Candida (62/98) não foram diferentes dos pacientes A+D- (75/93 e 52/93 , respectivamente). O crescimento excessivo de Candida entre os pacientes A-D+ (40/97, P=.003) foi menos frequente do que entre os pacientes AAD, mas a positividade de Candida não foi diferente (80/97, P=.612). Em indivíduos controle, a positividade e o sobrecrescimento de Candida foram menos comuns que em todos os outros grupos. A produção de seiva não diferiu entre pacientes com DAA e indivíduos controle (P=,568 e P=,590, respectivamente). Os dados indicam que contagens elevadas de Candida são resultado de tratamento antibiótico ou diarréia e não uma causa de DAA

Tordo oral e esofagite são as manifestações patológicas mais comuns das infecções por Candida . O papel da Candida na diarréia associada a antibióticos (DAA) tem sido debatido . As concentrações fecais de espécies de Candida do ⩾105 ufc/mL fezes têm sido consideradas como causadoras de diarréia em pacientes após terapia antibiótica. Tem sido relatado que pacientes que receberam antibióticos sem desenvolver diarréia tiveram <105 cfu Fungos de Candida/mL fezes

Proteinases de aspartílo segregado (Saps) são importantes fatores de virulência produzidos pelas espécies de Candida. Os sucos estão envolvidos na aderência de Candida albicans à mucosa humana e na invasão do tecido humano. Uma correlação entre a expressão de Saps e a virulência de Candida tem sido demonstrada na candidíase oral e na vaginite de Candida em pacientes infectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV). No DAA relacionado com candidíase, a secreção ativa mediada por uma toxina fúngica ou substâncias semelhantes a toxinas tem sido discutida como o mecanismo patogênico para diarréia. Em C. albicans foram identificados 10 genes diferentes de SAP . Em Candida tropicalis foi observada uma fraca atividade proteolítica extracelular, enquanto Candida glabrata não tem atividade proteolítica no ágar protéico

C. sabe-se que os albicanos produzem proteinases de aspartzo quando cultivados em meio com proteína como única fonte de nitrogênio , e a expressão do gene SAP2 é principalmente responsável pela atividade proteolítica observada na maioria das cepas que crescem na forma de levedura in vitro . Os sucos também mostram atividade proteolítica no trato gastrointestinal; a expressão de SAP na candidíase oral e a degradação da mucina gastrointestinal por Saps tem sido demonstrada. A degradação da mucina gastrointestinal pelas enzimas tem sido implicada como determinante da virulência de vários enteropatógenos (por exemplo, Vibrio cholerae, Shigella species, Helicobacter pylori e Yersinia enterocolitica) . Para C. albicans que coloniza superfícies mucosas, a degradação da mucina pelo SAP2 pode permitir uma aproximação mais próxima às células epiteliais e/ou modificação das superfícies celulares . Níveis mais altos de Candida acid proteinase secretora foram encontrados em crianças com diarréia aguda e crônica do que em indivíduos saudáveis de controle

Para elucidar a relevância patogênica da espécie Candida em pacientes adultos com DAA, realizamos culturas quantitativas de fezes para espécies Candida em 395 adultos imunocompetentes. Além disso, foi examinada a produção de Saps

Métodos

Selecção de doentes e colheita de amostras de fezesTodos os doentes de um departamento médico de 250 leitos foram pesquisados para diarreia ou para tratamento antibiótico na ausência de diarreia numa base diária durante 11 meses. Diarreia foi definida como >3 fezes moles ou aquosas por dia . O tratamento antibiótico foi definido como receber antibióticos orais ou intravenosos em doses terapêuticas para ⩾1 dia. AAD foi definido como >3 fezes pastosas ou aquosas por dia durante ou até 2 meses após o tratamento antibiótico . Os pacientes foram recrutados consecutivamente em 4 grupos de estudo até que os números pré-determinados necessários para a comparação estatística fossem alcançados (ver análise estatística abaixo). Os pacientes foram incluídos apenas uma vez durante a sua admissão hospitalar

Amostras de ferramentas de todos os pacientes com diarréia foram cultivados para patógenos bacterianos (salmonela, shigella, yersinia e campylobacter) em ágar seletivo, foram examinados para óvulos e parasitas, e foram testados para Clostridium difficile por cultura em ágar seletivo e pelo uso do teste rápido C. difficile (BD). Os doentes com qualquer um destes agentes patogénicos foram excluídos do estudo. Assim, 395 pacientes (195 com diarréia e 200 sem) foram incluídos no estudo e foram designados a 4 grupos: (1) grupo A+D+, 98 pacientes AAD recebendo antibióticos e experimentando diarréia; (2) grupo A+D-, 93 pacientes recebendo antibióticos mas não experimentando diarréia; (3) grupo A-D+, 97 pacientes não recebendo antibióticos mas experimentando diarréia; e (4) grupo A-D-, 107 indivíduos controle não recebendo antibióticos e não experimentando diarréia

Os 4 grupos não diferiram na distribuição de sexo e idade. Amostras de fezes de todos os sujeitos foram coletadas imediatamente após um movimento intestinal e levadas para o laboratório no mesmo prédio dentro de 15 min. As amostras de fezes passadas durante a noite foram armazenadas a 4°C e foram processadas na manhã seguinte

Culturas e esfregaços de fezes As amostras de fezes foram diluídas 1:10 com soro fisiológico, foram agitadas num homogeneizador de fezes e novamente diluídas 1:1000 e 1:10000 com soro fisiológico. Cem microlitros de cada diluição foram transferidos para um Candida CHROMagar (BBL) e foram banhados uniformemente com uma zaragatoa esterilizada. Após incubação a 37°C durante 48 h em ar ambiente, as colónias de Candida foram contadas e classificadas como C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis ou outras espécies de Candida, de acordo com a cor das colónias. Uma contagem das colônias ⩾105 cfu/mL stool foi classificada como “Candida overgrowth”, de acordo com Danna et al. . Um esfregaço de lâmina de cada diluição das primeiras 100 amostras consecutivas de fezes foi corado com a coloração de Gram e examinado por microscopia de luz para a presença de leveduras e leucócitos

Detecção de SapsOs isolados de Candida consecutivos dos grupos de pacientes A-D- e A+D+ foram testados para secreção de aspartílico proteinase em ágar de albumina bovina (BSA) (1,17% base de carbono de levedura, 0,01% extrato de levedura e 0,2% BSA ), como descrito em outra parte . O meio foi ajustado para pH 5,0, foi esterilizado por filtração (tamanho dos poros, 0,2 μm), e foi adicionado a uma solução de reserva de ágar autoclavado (2%). A proteólise, indicando atividade enzimática, foi medida em milímetros e foi pontuada como sugerido em outro lugar : – ou ± (não houve clarificação visível ou muito limitada do ágar em torno da colónia), 1+ (observou-se uma proteólise apreciável) e 2+ (a clarificação do ágar excedeu largamente a margem da colónia). A cepa C. albicans SC5314 e um mutante nulo SAP2 (fornecido por B. Hube, Universidade de Hamburgo, Alemanha) foram investigados como controles

Análise estatísticaUm número de pacientes com diferentes contagens de Candida em diferentes grupos foi comparado pelo uso do teste χ2, e as contagens de leveduras em esfregaços de lâmina foram correlacionadas com as contagens de Candida de culturas pelo uso da correlação de Pearson. As diferenças na produção de seiva foram calculadas pelo uso dos testes t de Student e exato de Fisher. O tamanho da amostra para o teste de cultura foi calculado como 91 pacientes avaliáveis, e para o teste de seiva, foi calculado como 20 pacientes avaliáveis por grupo, com um α de .05 e um poder de 0,8 (SigmaStat, versão 2.0; Jandel Scientific). As diferenças com P<.05 foram consideradas significativas

Resultados

Culturas de Candida e esfregaços de lâminaOs resultados das culturas de Candida são mostrados na figura 1. No grupo A+D+, a positividade de Candida (em 77/98 pacientes) e o crescimento excessivo de Candida (em 62/98 pacientes) não foram significativamente diferentes daqueles do grupo A+D- (75/93 pacientes e 52/93 pacientes, respectivamente). No grupo A-D+, o crescimento excessivo de Candida foi significativamente menos frequente do que no grupo A+D+ (P=.003), mas a positividade de Candida não foi significativamente diferente (P=.612). A positividade e o crescimento excessivo de Candida foram significativamente menos comuns no grupo A-D- do que em todos os outros grupos (positividade de Candida: 66/107 pacientes, P=.013, comparado com o grupo A+D+; P=.005, comparado com o grupo A+D-; e P=.002, comparado com o grupo A-D+; crescimento excessivo de Candida: 15/107 pacientes, P<.001, em comparação com todos os outros grupos; figura 1)

Análises explicativas usando diferentes cortes para a definição de crescimento excessivo de Candida (103, 104, 106, ou 107 ufc/ml fezes) produziram resultados qualitativamente similares. Em todos os cálculos, o sobrecrescimento de Candida foi significativamente menos comum no grupo A-D- do que em todos os outros grupos. C. albicans foi o isolado mais frequente (216 de 395 pacientes) seguido por C. glabrata (104 de 395 pacientes), C. tropicalis (21 de 395 pacientes), C. krusei (11 de 395 pacientes), e outras espécies de Candida (97 de 395 pacientes). Culturas mistas de Candida foram encontradas em 122 (31%) dos 395 pacientes. A contagem de leveduras em esfregaços de lâmina não se correlacionou com a contagem de culturas (r=.27; figura 2)

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Resultados da atividade proteolítica em ágar BSA agarOverall, 23 isolados A+D+ e 20 isolados A-D-Candida foram testados para atividade proteolítica em ágar BSA. A atividade média±SD foi 1,26±1,06mm para o grupo A+D+ e 1,42±0,64mm para o grupo A-D-. Dos 23 isolados A+D+, 16 tiveram um escore de proteólise de 1+ (zona de clarificação de 1-2 mm) e 1 teve um escore de 2+ (zona de clarificação de 3-5 mm), ambos indicando a presença de atividade da enzima proteinase. Dos 20 isolados A-D, 17 tinham um escore de proteólise de 1+ e 2 tinham um escore de 2+. Todos os isolados de C. albicans mostraram zonas de clarificação em meio BSA (⩾1 mm, ⩾1+ escore). No grupo A-D-, 1 C. tropicalis isolados não mostraram proteólise. No grupo A+D+, 5 C. isolados de glabrata e 1 C. tropicalis isolados não mostraram proteólise. As zonas de clarificação dos grupos A-D- e A+D+ não foram significativamente diferentes quando medidas em milímetros (P=,568, teste t de Student) ou com o sistema de pontuação 1+/2+ (P=,294 e P=,590 para isolados com pontuação 1+ e 2+, respectivamente, teste exato de Fisher) . Quando os isolados de C. glabrata (que são conhecidos por serem negativos em ágar protéico) foram eliminados, não houve diferença significativa na produção de seiva entre os grupos (P=.347)

Discussão

Candida overgrowth foi postulada para causar DAA . Investigamos a presença e quantidade de espécies de Candida em pacientes suspeitos de ter DAA, pacientes sem diarréia mas tomando antibióticos, pacientes com diarréia mas não tomando antibióticos, e pacientes sem diarréia e não tomando antibióticos (indivíduos controle). Uma proporção significativamente maior de amostras de fezes de pacientes recebendo terapia antimicrobiana e experimentando diarréia (grupo A+D+) foi positiva para a espécie Candida e teve maior contagem de colônias do que as amostras de indivíduos-controle (grupo A-D-). Em um estudo de Danna et al. , Candida overgrowth (⩾105 cfu/mL stool) foi visto em 7 (29%) de 24 pacientes com DAA. Nesse estudo, 0 dos 24 pacientes sem diarréia, mas recebendo antibióticos, apresentava crescimento excessivo de Candida. Entretanto, em nosso estudo, 52 (56%) dos 93 pacientes com antibióticos, mas sem diarréia, apresentaram crescimento excessivo de Candida, e nenhuma diferença foi observada, em comparação com os pacientes com DAA. Como investigamos um número quase 4 vezes maior de pacientes (93 vs. 24), as diferenças entre nossos achados e os de Danna et al. podem ser devidas ao maior tamanho da amostra em nosso estudo

Para avaliar a influência da diarréia na contagem de Candida intestinal, também investigamos pacientes que não receberam antibioticoterapia, mas que tinham diarréia (grupo A-D+). Neste grupo, o crescimento excessivo de Candida (⩾105 cfu/mL stool) foi significativamente menos frequente do que nos pacientes com DAA, mas a positividade de Candida não foi significativamente diferente. Estudos prévios mostraram que a flora de fezes normais estava nitidamente diminuída em pacientes com DAA. Em estudos nos quais foram investigados os efeitos dos antibióticos de largo espectro na composição da microflora intestinal de humanos, foi observada uma correlação inversa significativa entre o log do aumento máximo das leveduras e o log da diminuição máxima dos anaeróbios. Como encontramos aumento da positividade de Candida em pacientes AAD, A+D- e A-D+, sugerimos que a diminuição de bactérias nas fezes, devido à antibioticoterapia ou diluição em diarréia, permitiu a expansão da espécie Candida, resultando em aumento da positividade de Candida

Em nosso estudo, a média de contagens de leveduras em esfregaços corados com a coloração de Gram não se correlacionou com as culturas de Candida quando calculadas com o número total de leveduras em esfregaços de lâminas (r=.27) ou com o índice sugerido por Danna et al. (r=.12). A discrepância entre um grande número de células semelhantes a leveduras contadas sob um microscópio de luz e o crescimento pobre ou ausente das espécies Candida foi relatada em outro lugar 15]. Nesse estudo, os autores presumiram que a grande maioria das leveduras em fezes detectadas sob o microscópio não estavam vivas . Nossos resultados indicaram que grande cautela deve ser exercida na interpretação de amostras de fezes de pacientes com DAA e positivas para as espécies de Candida. A utilidade da análise de fezes para Candida conta por cultura ou esfregaço de fezes nestes pacientes é seriamente questionada. A ausência de leucócitos nas amostras coradas com a coloração de Gram foi consistente com os achados anteriores. Nossos resultados também confirmaram que as espécies de Candida faziam parte da flora intestinal normal

Secreção ativa mediada por uma toxina fúngica ou substâncias semelhantes a toxinas tem sido discutida como o mecanismo para a AAD relacionada a candida-. Como os sucos são os principais fatores de virulência nas infecções por Candida, investigamos estas proteinases in vitro. Até à data, foram identificados 10 genes diferentes de SAP em C. albicans . Como a seiva tem sido relatada como contribuindo para a lesão tecidual em um modelo de candidose oral humana, estas proteinases também podem danificar as células epiteliais intestinais. Mas em 8 pacientes suspeitos de ter DAA relacionada a C. albicans, não houve evidência de colite ou dano celular

Em nosso estudo, todas as cepas de C. albicans investigadas produziram Saps, e não houve diferença significativa entre a quantidade de Saps produzidos em Candida isolados de pacientes com DAA e sujeitos de controle. Foram encontrados níveis mais elevados de proteinases secretoras de ácido Candida em crianças com diarréia aguda e crônica do que em indivíduos controle saudáveis. Embora os níveis de seiva calculados para todo o grupo de crianças com diarréia aguda ou crônica fossem significativamente maiores do que os níveis em indivíduos controle, este não foi o caso em casos isolados. Dos 9 isolados de Candida, 4 dos indivíduos controle (crianças sem diarréia) tinham níveis de seiva comparáveis aos de crianças com diarréia crônica, e 2 dos 9 indivíduos controle tinham níveis comparáveis aos de crianças com diarréia aguda. Apesar desses altos níveis de seiva, os sujeitos de controle não tinham diarréia. Isso contrasta com os achados de estudos anteriores, nos quais a produção de seiva em pacientes sintomáticos sempre atingiu níveis mais altos do que em indivíduos controle: A produção de seiva por espécies de Candida a partir de pacientes com vaginite sempre excedeu a produção de seiva por Candida a partir de portadores, e as cepas de Candida a partir de candidíase oral em pacientes com AIDS produziram ∼8 – mais seiva do que a produzida por indivíduos controle

A produção de seiva é coerentemente indicada pelo teste de ágar BSA e ELISA . Além disso, níveis elevados de seiva secretada in vitro e detectada pelo ágar BSA ou ELISA correlacionaram-se com níveis aumentados de seiva in vivo (por exemplo, em fluidos vaginais de pacientes com vaginite HIV-positiva) . Pode-se especular que a espécie Candida produz temporariamente altos níveis de seiva in vivo, mas perde essa capacidade devido, por exemplo, à subcultura. Em C. albicans isolados de cavidades orais, foi demonstrado que a produção elevada de seiva era uma característica estável. Por outro lado, C. albicans isolados com baixa produção de proteinase mostraram produção estável de seiva em subculturas repetidas

Em resumo, os resultados de nosso estudo não confirmam os mecanismos patogênicos previamente sugeridos de DAA relacionados com Candida-. Nossos dados indicam que contagens elevadas de Candida são resultado de tratamento antibiótico ou diarréia per se, e não uma causa de DAA. A produção do principal fator de virulência fúngica Sap em pacientes com DAA não diferiu da dos sujeitos de controle, o que indica que esta toxina fúngica pode não ser responsável pela DAA em adultos. Outros fatores de virulência fúngica (por exemplo phospholipases) warrant further investigation