Îmbunătățirea pe termen lung a masei și rezistenței mușchilor scheletici prin administrarea unei singure gene de inhibitori ai mioztatinei
Rezultate și discuții
Livrarea de gene în mușchi mediată de AAV oferă un sistem pentru a genera niveluri ridicate de proteine în țesutul țintă sau printr-un produs secretat transportat în locuri îndepărtate prin circulație (19). Am clonat genele cunoscute de inhibare a mioztatinei secretate, inclusiv proteina serică-1 (GASP-1) asociată factorului de creștere și diferențiere (18), gena legată de follistatină (FLRG) (17) și follistatina-344 (FS) (13) în serotipul AAV 1, care au demonstrat capacități ridicate de transducție musculară. Există două izoforme de follistatină generate prin splicing alternativ. Varianta FS-344 suferă o scindare peptidică pentru a genera izoforma FS-315, iar cealaltă variantă FS-317 produce izoforma FS-288 după scindare peptidică. Noi am utilizat varianta umană FS-344, care generează exclusiv izoforma FS-315 a FS care circulă în ser și include o regiune acidă C-terminală (20). Am ales FS-344 (FS), deoarece cealaltă izoformă FS-317, lipsită de terminația C, prezintă o localizare preferențială în lichidul folicular ovarian și o afinitate de legare tisulară ridicată prin intermediul proteoglicanilor de heparină sulfat, ceea ce poate afecta capacitatea de reproducere și se poate lega la alte situsuri ne-țintă (21). FS-288 reprezintă forma legată de membrană a follistatinei (22), este un supresor puternic al hormonului de stimulare a foliculului hipofizar (23), se găsește în lichidul folicular al ovarului și în testicule și demonstrează o afinitate ridicată pentru celulele granuloase ale ovarului.
Am încercat să determinăm eficacitatea acestor proteine pentru a crește masa musculară la șoarecii normali și distrofici. Am administrat 1 × 1011 particule virale AAV1 per animal care codifică FS, FLRG, GASP-1 sau GFP bilateral în mușchii cvadriceps și tibialis anterior ai șoarecilor C57BL/6 de tip sălbatic în vârstă de 4 săptămâni. Toate animalele tratate cu inhibitori ai mioztatinei au demonstrat o creștere a masei corporale cu o îmbunătățire grosieră observabilă a mușchilor atunci când au fost analizate la 725 de zile de vârstă, comparativ cu martorii tratați cu GFP (Fig. 1 a și b). Evaluarea greutății individuale a mușchilor a arătat o creștere a masei musculare pentru toate animalele tratate cu inhibitori de mioztatină, cu cea mai mare creștere la animalele tratate cu FS. Creșterea masei musculare a fost constatată în mușchii membrelor posterioare injectate și în mușchii îndepărtați de locul de injectare, cum ar fi tricepsul. Astfel, acești inhibitori au fost secretați în circulație de la locul de injectare a mușchilor, sporind masa musculară scheletală în locurile îndepărtate (Fig. 1 c). Masa musculară mărită a fost însoțită de o îmbunătățire funcțională demonstrată de o creștere a forței de prindere a membrelor posterioare (Fig. 1 d). Nu a existat niciun efect asupra masei cardiace sau asupra aspectului histologic al cardiomiocitelor, ceea ce indică faptul că inhibiția mioztatinei a fost selectivă pentru țesutul muscular scheletic (datele nu sunt prezentate). A existat îngrijorarea că FS afectează în mod negativ funcția gonadică. Nu am constatat nicio modificare a capacității de reproducere la șoarecii tratați cu AAV1 al nostru purtător al transgenei FS344 (AAV1-FS, tabelul 1) În plus, nu am constatat nicio modificare histologică/patologică în țesutul gonadal al șoarecilor tratați cu FS în comparație cu martorii (datele nu sunt prezentate).
Proteinele inhibitoare de mioztatină cresc masa și forța musculară la șoarecii C57BL/6 de tip sălbatic. (a) Masa musculară brută a membrelor posterioare este crescută la toți șoarecii tratați cu proteine inhibitoare de mioztatină la 725 de zile de vârstă, comparativ cu martorii injectați cu AAV1-GFP. (b) Masa corporală totală este semnificativ crescută la șoarecii injectați cu AAV1-FS (**, P ≤ 0,01) și AAV1-GASP-1 (*, P ≤ 0,05) în comparație cu martorii AAV1-GFP la 725 de zile de vârstă (n = 10). (c) Masa mușchilor individuali ai membrelor posterioare și anterioare este crescută la șoarecii injectați cu AAV care exprimă proteine inhibitoare de mio-statină (n = 10). *, P ≤ 0.05. (d) Forța de prindere a membrelor posterioare se îmbunătățește >2 ani la toți șoarecii tratați, cu cele mai mari diferențe la animalele tratate cu AAV1-FS în comparație cu controalele AAV1-GFP (n = 10). Barele de eroare reprezintă eroarea standard.
- Vezi în linie
- Vezi popup
Reproducerea a fost normală la animalele tratate cu AAV1-FS
Datorită efectelor robuste ale administrării FS, am testat în continuare potențialul AAV1-FS administrat postnatal într-o paradigmă semnificativă din punct de vedere clinic pentru a crește masa și forța musculară și pentru a întârzia deteriorarea musculară în modelul de șoarece mdx de distrofie musculară Duchenne (DMD). DMD este o boală recesivă legată de cromozomielită X care duce la deteriorarea mușchilor scheletici și a funcției cardiace, ducând în cele din urmă la deces. Recent, FS a fost investigată la animalele mdx care supraexprimă un domeniu duplicat al genei follistatin. Rezultatele au demonstrat o creștere a masei musculare și o atenuare a patologiei, deși rezultatele au fost documentate doar până la vârsta de 15 săptămâni (24). În studiile noastre, animalele mdx au fost injectate bilateral în mușchii cvadriceps și tibialis anterior cu o doză mică (1 × 1010 particule virale) sau mare (1 × 1011 particule virale) de AAV1-FS la vârsta de 3 săptămâni și au fost urmărite timp de 5 luni înainte de necropsie. S-au detectat niveluri crescute de FS circulant în serul animalelor tratate atât cu doze mici, cât și cu doze mari, doza mare exprimând cele mai mari niveluri de FS detectate în ser (doza mare, 15,3 ± 2,1 ng/ml; doza mică, 6,8 ± 0,4 ng/ml; controale GFP, 0 ± 0,1 ng/ml; n = 8 per grup; P < 0,01). Am demonstrat că AAV1-FS a crescut masa corporală în comparație cu controalele tratate cu GFP, cu cea mai mare creștere în grupul FS cu doză mare (datele nu sunt prezentate). Observarea grosieră a șoarecilor tratați cu AAV1-FS a arătat o creștere semnificativă a dimensiunii mușchilor în comparație cu animalele tratate cu AAV1-GFP (Fig. 2 a), cu cea mai mare creștere a masei musculare individuale la animalele tratate cu doze mari de FS (Fig. 2 b). Efectele nu s-au limitat la mușchii injectați; acestea au fost constatate, de asemenea, în locurile îndepărtate de mușchii direct vizați (Fig. 2 b). Creșterea masei musculare s-a tradus printr-o îmbunătățire dependentă de doză a forței musculare în membrele posterioare și anterioare ale animalelor tratate în comparație cu controalele tratate cu GFP (Fig. 2 c). Analizele histologice și morfometrice ale mușchilor injectați cu AAV1-FS și în locuri îndepărtate au demonstrat hipertrofia miofibrelor, susținând observațiile grosiere făcute în momentul necropsiei (Fig. 3 a-c). Mai mult, nu a existat nicio schimbare a tipurilor de fibre musculare la animalele tratate cu AAV-FS; cu toate acestea, existau mai puține fibre totale pe milimetru pătrat de suprafață în mușchiul tibialis anterior la animalele tratate cu doza mare de AAV-FS (Fig. 3 d și e). În mod frapant, șoarecii tratați cu FS au demonstrat o reducere semnificativă a creatin kinazei serice în comparație cu controalele tratate cu GFP (Fig. 4 a). Acest lucru este interesant, deoarece FS a fost protector în ciuda lipsei sale de corecție a deficienței de distrofină subiacente. Mecanismul exact nu este clar, dar s-ar putea specula că mărirea rezistenței fibrelor individuale le face mai puțin susceptibile la deteriorări cauzate de stresul activităților normale. Implicarea celulelor satelit în inhibarea postnatală a mioztatinei rămâne să fie pe deplin rezolvată; cu toate acestea, nu am observat o modificare statistică a markerilor celulelor satelit musculare pentru animalele tratate cu FS (datele nu sunt prezentate).
O singură injecție de AAV1-FS crește masa și forța musculară la șoarecii mdx tineri. (a) Masa musculară brută a membrelor posterioare este crescută la animalele mdx injectate cu AAV1-FS la vârsta de 180 de zile în comparație cu controalele injectate cu AAV1-GFP. (b) Masa mușchilor individuali ai membrelor posterioare și anterioare este crescută la vârsta de 180 de zile la șoarecii injectați la vârsta de 3 săptămâni cu AAV1-FS în comparație cu controalele AAV1-GFP (n = 15). *, P ≤ 0.05. (c) Forța de prindere este îmbunătățită într-o manieră dependentă de doză la șoarecii mdx tineri injectați la vârsta de 3 săptămâni cu AAV1-FS urmăriți timp de 180 de zile (n = 15). Roșu, doze mari de AAV1-FS; albastru, doze mici de AAV1-FS; verde, controale AAV1-GFP. Barele de eroare reprezintă erorile standard.
Șoarecii mdx tratați cu AAV1-FS la vârsta de 3 săptămâni și urmăriți timp de 180 de zile demonstrează hipertrofia miofibrelor. (a) Colorația HE a tibialului anterior relevă hipertrofia miofibrelor în mușchiul injectat cu AAV1-FS în comparație cu controlul AAV1-GFP. (Mărire originală, ×40.) (b) Diametrul mediu al miofibrelor întunecate (oxidative cu contracție lentă), intermediare (glicolitice oxidative cu contracție rapidă) și ușoare (glicolitice cu contracție rapidă) din tibialis anterior (indicat prin linia hașurată) este semnificativ crescut la șoarecii injectați cu AAV1-FS în comparație cu martorii injectați cu AAV1-GFP. (P < 0,001; n = 5). (c) Diametrul mediu al miofibrelor intermediare și ușoare (indicate prin linia hașurată) în triceps este semnificativ crescut la șoarecii injectați cu AAV1-FS în comparație cu controalele injectate cu AAV1-GFP. (P < 0,001; n = 5.) (d) Distribuția fibrelor întunecate, intermediare și ușoare, determinată prin colorarea cu dehidrogenază succinică (SDH), nu este modificată de tratamentul cu doze mari sau mici de AAV1-FS. (P > 0,05 între toate grupurile; n = 5.) (e) Numărul mediu de fibre numărate pe un cadru de numărare imparțială de 0,14 mm2 este diminuat în tibialis anterior al șoarecilor tratați cu AAV1-FS, având în vedere că diametrul mediu al miofibrilelor este crescut. (*, P < 0,01; n = 5.) Barele de eroare reprezintă erori standard.
Șoarecii mdx tratați cu AAV1-FS prezintă o scădere a markerilor de deteriorare musculară și șoarecii mdx în vârstă răspund la tratamentul FS cu beneficii funcționale. (a) Nivelurile serice de creatin-kinază (unități/litru) sunt scăzute la 3 luni după injectarea cu AAV1-FS în comparație cu martorii injectați cu AAV1-GFP. (*, P < 0,05; n = 10.) Barele de eroare reprezintă erori standard. (b) Forța de prindere a membrelor posterioare este semnificativ crescută (P ≤ 0,05) la 275 de zile și ulterior la șoarecii mdx în vârstă tratați cu AAV1-FS la 210 zile de vârstă (n = 15). Roșu, doze mari de AAV1-FS; verde, controale AAV1-GFP. (c) Colorația HE a gastrocnemiului îmbătrânit demonstrează o patologie redusă atunci când este injectat la 210 zile de vârstă cu FS în comparație cu controalele injectate cu GFP. (Mărire originală, ×40.) (d) Diafragma colorată cu HE a animalelor injectate la 210 zile de vârstă cu FS prezintă o înlocuire mai redusă a grăsimii decât controalele injectate cu GFP în stadiul târziu. (Mărire originală, ×20.)
Am evaluat, de asemenea, potențialul AAV1-FS de a crește forța musculară la animalele mdx atunci când sunt tratate la o vârstă mai înaintată. Am constatat că injectarea AAV1-FS la vârsta de 210 zile a crescut forța musculară ≈60 de zile după administrare și că forța crescută a persistat pe termen lung de-a lungul celor 560 de zile evaluate în acest studiu (Fig. 4 b). Încă de la vârsta de 180 de zile, înainte de tratamentul cu AAV1-FS, a existat o patologie evidentă în mușchii animalelor mdx netratate, cu proliferare proeminentă a țesutului conjunctiv endomisial și inflamație (Fig. 4 c și d). Evaluarea patologică a mușchilor gastrocnemieni și diafragmatici la vârsta de 560 de zile a demonstrat că animalele tratate cu AAV1-FS aveau substanțial mai puține grupuri focale de fibre musculare necrotice și infiltrate de celule mononucleare. În mod important, animalele tratate cu AAV1-FS au avut zone focale semnificativ reduse de proliferare endomisială a țesutului conjunctiv, care au fost pronunțate la animalele tratate cu GFP, demonstrând că fibroza, un semn distinctiv al distrofiei musculare, a fost redusă la animalele tratate cu FS (Fig. 4 c). Patologia în diafragmă a arătat, de asemenea, că tratamentul cu FS a redus inflamația și înlocuirea grăsimii în comparație cu animalele tratate cu GFP (Fig. 4 d). Mai mult, tratamentul cu AAV1-FS a demonstrat creșteri semnificative ale diametrului fibrelor musculare la această vârstă în comparație cu animalele de control tratate cu GFP (Fig. 4 c și d). Aceste rezultate au demonstrat că inhibarea miostatinei prin tratamentul cu FS a fost benefică la animalele mdx în vârstă care au trecut prin mai multe runde de degenerare și regenerare musculară. Transpunerea la o paralelă clinică sugerează că terapia genică FS mediată de AAV ar putea avea potențial pentru pacientul DMD în vârstă, independent de înlocuirea genei lipsă și ar putea avea un rol potențial în terapia combinațională, similar cu cel demonstrat pentru înlocuirea genei IGF-1 și a minidistrofinei (25).
Aceste rezultate sugerează că inhibarea miostatinei prin FS-344, administrată printr-o singură injecție AAV1, poate spori dimensiunea și forța musculară și este bine tolerată timp de >2 ani. Rezultatele FS344 pot oferi o strategie mai puternică decât altele care vizează exclusiv mioztatina, din cauza efectelor adiționale, cum ar fi implicarea follistatinei în mai multe căi de semnalizare, precum și a descoperirii recente care demonstrează o reducere a inflamației într-un model de endotoxemie (15, 26). Capacitatea izbitoare a FS de a asigura o îmbunătățire grosieră și funcțională pe termen lung a mușchilor distrofici la animalele în vârstă justifică luarea sa în considerare pentru dezvoltarea clinică în vederea tratării bolilor musculo-scheletice, inclusiv a pacienților vârstnici cu DMD.