Determinarea mutației V617F a genei JAK2 în sindroamele mieloproliferative cronice din țara noastră: prezentare de caz
Determinarea mutației V617F a genei JAK2 în sindroamele mieloproliferative cronice din țara noastră: prezentare de caz
Dr. Daniela Lens*, Pablo Muxi†, Lics. Andreína Brugnini‡,
Natalia Trías‡, Dra. Silvia Pierri§
Spitalul de clinici. Facultatea de Medicină.
Universitatea din Republica. Montevideo, Uruguay
Abstract
Politemia vera (PV), trombocitemia esențială (ET) și mielofibroza idiopatică (IM) sunt tulburări mieloproliferative clonale strâns legate între ele, caracterizate prin proliferarea excesivă a uneia sau mai multor linii mieloide, cum ar fi eritrocitele, trombocitele și fibroblastele din măduva osoasă.
În timp ce există criterii stricte pentru diagnosticarea acestor sindroame mieloproliferative, clasificarea precisă rămâne o chestiune de dezbatere și, în plus, aceste afecțiuni sunt dificil de diferențiat de procesele reactive în multe cazuri.
Recent, în 2005, a fost identificată o mutație în gena tirosin-kinazei Janus kinazei 2 (JAK2) în mai multe dintre aceste entități. Această mutație implică înlocuirea unui G cu un T la poziția 1849, ceea ce duce la înlocuirea unei fenilalanine cu o valină în proteină (JAK2 V617F).
Incidența acestei mutații a fost observată în aproximativ 90% din cazurile cu PV și în aproximativ 50% din cazurile cu IM și ET.
În această lucrare vom descrie detectarea acestei mutații la un pacient cu diagnostic de PV probabilă, folosind un test de reacție în lanț a polimerazei (PCR) foarte sensibil pentru detectarea acestei mutații și vom discuta importanța acestei mutații recent descoperite în diagnosticul și tratamentul sindroamelor mieloproliferative BCR-ABL-negative.
Locuri cheie: BOALDE MIELOPROLIFERATIVE – diagnostic.
MUTAȚIE – genetică.
PROTEIN-TYROSINE KINASE.
* Profesor asociat. Departamentul de bază de medicină.
† Profesor asociat. Clinica de hematologie. Departamentul Clinic de Medicină.
‡ Biochimie Lic. Asistent. Departamentul de Medicină de bază.
§ Profesor asociat. Clinica de hematologie. Departamentul Clinic de Medicină.
Correspondență: Dr. Daniela Lens.
Departament. Medicină de bază. Hospital de Clínicas. Piso 15. Avda Italia s/n. Montevideo CP 11600. Montevideo, Uruguay.
Email: [email protected]
Recepționat: 31/7/06.
Acceptat: 26/2/07.
Introducere
În contrast cu leucemia mieloidă cronică, unde identificarea rearanjamentului specific BCR-ABL a dus la un progres în diagnosticarea, monitorizarea și tratamentul acestei entități, în sindroamele mieloproliferative cronice (PMS) BCR-ABL negative, cum ar fi policitemia vera (PV), trombocitemia esențială (ET) și mielofibroza idiopatică (IM), nu se cunoșteau modificări genetice specifice până foarte recent.
Între mai și iunie 2005, cinci grupuri de cercetători au descris o nouă mutație punctiformă în gena tirozin kinazei JAK2, datorată înlocuirii unei guanine cu o timină la nucleotidul 1849 din exonul 14, ceea ce duce la înlocuirea unei valine cu o fenilalanină în poziția 617 a proteinei, mutație pentru care mutația JAK2 este denumită V617F(1-5).
Această mutație a fost observată în aproximativ 90% din cazurile cu PV atunci când se utilizează teste de înaltă sensibilitate pentru a o detecta(6). A fost, de asemenea, găsită în aproximativ 50% din cazurile cu IM și ET, în timp ce nu a fost găsită la subiecții sănătoși sau la pacienții cu eritrocitoză secundară, astfel încât această mutație are o valoare predictivă foarte mare pentru a distinge SMPC de afecțiuni non-clonale, cum ar fi policitemia secundară.
Această mutație apare într-o regiune foarte conservată a unui domeniu autoinhibitor care reglează negativ semnalizarea JAK2. Mai multe studii au arătat că această mutație este implicată în patogeneza acestor afecțiuni, în special datorită unui câștig de funcție a genei JAK2 și printr-o pierdere de control care sunt asociate cu mieloproliferarea excesivă a acestor afecțiuni.
În această lucrare vom descrie detectarea acestei mutații la un pacient cu diagnostic de PV probabilă și vom discuta importanța acestei noi mutații în diagnosticul și tratamentul SMP BCR-ABL negativ.
Material și metodă
Extragerea acidului dezoxiribonucleic
Extragerea acidului dezoxiribonucleic (ADN) genomic a fost realizată din 1 ml de sânge periferic citrat, folosind reactivul comercial dnazol (Life Techno-logies) și urmând protocolul indicat de producător. Probele de ADN au fost păstrate la 4°C.
Detecția mutației Vl617F
Mutația V617F a fost detectată din ADN genomic obținut anterior prin reacția în lanț a polimerazei (PCR) specifică alelei, în conformitate cu metoda publicată de Baxter et al(1). Această PCR este concepută pentru a utiliza trei primeri diferiți, numiți JAK2R, JAK2F/IC și JAK2F (tabelul 1). Primerul JAK2F este specific pentru alela mutantă, iar primerul JAK2F/IC se găsește la toți indivizii, indiferent de prezența sau absența mutației, constituind astfel un control intern al reacției. Astfel, la toți indivizii se amplifică un produs de 364 perechi de baze (pb) cu primerii JAK2F/IC și JAK2R și numai la indivizii cu mutația studiată se obține un produs de 203 pb cu ajutorul primerilor JAK2F și JAK2R (figura 1).
Amplificarea RCP a fost realizată într-un volum final de 20 uL folosind 500 ng de ADN, 200 mM/L din fiecare dNTP, 0,5 U de polimerază Taq (New England Biolabs) și 2 uL de tampon Taq 10x care conține 2 mM MgCl (New England Biolabs), 0,5 mM de amorse JAK2 F și JAK2 F/IC și 1 mM de amorse JAK2 R.
Programul PCR utilizat constă în 36 de cicluri, începând cu o denaturare de 5 minute, apoi cicluri: 30 de secunde la 94°C, 30 de secunde la 58°C și 30 de secunde la 72°C, terminând cu o extensie finală de 5 minute. În toate reacțiile s-a inclus întotdeauna un martor negativ care conține toți reactivii necesari pentru amplificare și în care șablonul ADN este înlocuit cu apă. Verificarea produsului PCR așteptat a fost efectuată pe un gel de agaroză 2% colorat cu bromură de etidiu(7).
Analiză de caz
Pacient de sex masculin, în vârstă de 72 de ani, fumător înrăit, cu hipertensiune arterială cronică sub tratament și purtător al unei arteriopatii obstructive cronice care în anul 2002 a determinat o amputație a degetului cinci de la piciorul stâng. În decembrie 2004, prezentând un nou episod obstructiv la nivelul membrului inferior stâng, hemograma a arătat o creștere a numărului de globule roșii, cu un hematocrit de 66%, împreună cu o granulocitoză de 24.000 și trombocite de 245.000. Hematocritul a rămas același, iar numărul de trombocite a crescut progresiv până la 710.000. În studiul de biopsie a măduvei osoase, s-a observat o măduvă osoasă hipercelulară cu hiperplazie a seriei eritroide, ceea ce a dus la concluzia unui sindrom mieloproliferativ cronic de tip PV.
Pacienta a fost tratată cu flebotomii și în mai 2005 a început tratamentul cu hidroxiuree, care a fost întrerupt în februarie 2006 din cauza unei complicații hemoragice.
Așa cum este ilustrat în figura 2, pacienta a prezentat un pattern cu două benzi în studiul PCR specific alelei pentru mutația V617F a genei JAK2. Pe de o parte, banda de control de 364 pb, care este prezentă și la cei doi martori sănătoși studiați. Pe de altă parte, un produs de 203 pb a fost, de asemenea, amplificat la pacientul care a demonstrat prezența mutației. Această bandă nu a fost observată la martorii sănătoși.
Discuție și concluzii
În această lucrare am descris primul caz în care a fost identificată mutația V617 a genei JAK2 în țara noastră. Această lucrare face parte dintr-un proiect multidisciplinar între Departamentul de Medicină de Bază și Serviciul de Hematologie al Spitalului de Clinici, în vederea determinării prezenței acestei mutații la 100 de pacienți cu SPM BCR-ABL-negativ.
Recenta identificare a mutației activatoare V617F în gena JAK2 reprezintă un progres important în cunoașterea patogenezei sindroamelor mieloproliferative BCR-ABL-negativ. Datorită frecvenței ridicate în care această mutație este întâlnită în PV și, într-o măsură mai mică, în ET și IM, s-a emis ipoteza că detectarea acestei mutații ar avea un impact puternic asupra diagnosticului, clasificării și tratamentului acestor entități. Diferite grupuri au propus încorporarea detectării acestei mutații ca test de diagnostic de primă linie atunci când există un hematocrit mai mare de 51% sau când se suspectează PV, având în vedere că detectarea JAK2 V617F are o valoare predictivă pozitivă de 100% pentru diagnosticul de PV(8,9). Pe de altă parte, mai mulți autori au postulat că prezența acestei mutații ar permite o nouă clasificare a PMS, deoarece ET, PV și MI purtătoare ale mutației JAK2 ar putea reprezenta aceeași boală în diferite stadii evolutive, în loc de entități diferite(10-12). Cu toate acestea, valoarea clinică exactă și beneficiul detectării acestei mutații rămân de stabilit și necesită studii clinice prospective special concepute pentru a rezolva aceste întrebări.
În plus, descoperirea acestei mutații deschide noi perspective pentru terapii care să vizeze în mod specific proteina kinaza mutantă, similar cu inhibitorii BCR-ABL în leucemiile mieloide cronice.
Rezumat
Politemia vera (PV), trombocitemia esențială (ET-TE) și mielofibroza idiopatică (IM-MI) sunt afecțiuni mieloproliferative clonale caracterizate de o proliferare excesivă a uneia sau mai multor linii mieloide, cum ar fi eritrocitele, trombocitele și fibroblastele din măduva osoasă.
Clasificarea precisă a sindroamelor mieloproliferative trebuie încă dezbătută, chiar dacă criteriile de diagnostic sunt stricte; în plus, aceste afecțiuni sunt dificil de diferențiat de procesele reactive.
Recent, în 2005, a fost identificată mutația JAK2 în multe dintre aceste entități. Secvențierea regiunii codificatoare a JAK2 a evidențiat o translație G-T la poziția 1849, care a schimbat o valină cu o fenilalanină (JAK2 V617F).
Incidența mutației V617F-JAK2 a fost de aproape 90% la pacienții cu PV și de 50% la pacienții cu IM și ET.
În acest studiu descriem detectarea mutației V617F-JAK2 la un pacient suspectat de PV folosind analiza reacției în lanț a polimerazei (PCR) specifice alelei și discutăm importanța mutației pentru diagnosticul și tratamentul sindroamelor mieloproliferative BCR-ABL negative.
Rezumat
La polycytémie vera (PV), Trombocitemia esențială (TE) și mielofibroza idiopatică (MI) sunt tulburări mieloproliferative clonale strâns legate între ele, caracterizate prin proliferarea excesivă a uneia sau mai multor linii mieloide, cum ar fi eritrocitele, trombocitele și fibroblastele din măduva osoasă.
Deși există criterii stricte pentru diagnosticul acestor sindroame mieloproliferative, categorisirea precisă rămâne un subiect de dezbatere și, în plus, aceste tulburări sunt dificil de diferențiat de procesele reactive în mai multe ocazii.
Recent, în 2005, o mutație în gena tirozin kinazei Janus kinaza 2 (JAK2) a fost identificată în câteva dintre aceste entități. Această mutație constă în înlocuirea unui G cu un T în poziția 1849, ceea ce duce la înlocuirea în proteină a unei fenilalanine cu valină (JAK2 V617F).
Incidența acestei mutații a fost observată în aproape 90% din cazurile cu PV și, în aproximativ 50% din cazurile cu IM și TE.
În această lucrare vom descrie detectarea acestei mutații la un pacient cu diagnostic de PV probabilă prin intermediul unui test de reacție în lanț a polimerazei (PCR) cu sensibilitate ridicată pentru detectarea acestei mutații și vom discuta importanța acestei mutații nou descoperite în diagnosticul și tratamentul BCR-.Sindroame mieloproliferative ABL negative.
Rezumat
Politemia Vera (PV), trombocitemia hemoragică (TE) și mielofibroza idiopată (MI) sunt trăsături mieloproliferative clonale puternic legate și caracterizate de o proliferare excesivă a uneia sau mai multor linii de mielide, cum ar fi eritrocitele, plăcuțele și fibroblastele din medula osoasă.
Chiar dacă există criterii riguroase pentru diagnosticarea acestor sindroame mieloproliferative, clasificarea precisă continuă să fie discutată; de multe ori este foarte dificil de diferențiat aceste disturbiile de procese repetitive.
În 2005, în mai multe dintre aceste entități a fost identificată o mutație în gena tirozin kinazei Janus kinaza 2 (JAK2). În această mutație, se observă o substituție de la G la T în poziția 1849, ceea ce duce la o substituție de la fenilalanină la valină (JAK2 V617F) în proteină.
Această mutație a fost observată în aproximativ 90% din cazurile cu PV și în aproximativ 50% din cazurile cu IM și TE.
În această lucrare descriem detectarea acestei mutații la un pacient cu un diagnostic probabil de PV folosind un test de reacție în lanț a polimerazei (PCR) foarte sensibil pentru detectarea acestei mutații și discutăm importanța acestei mutații nou descoperite în diagnosticul și tratamentul sindroamelor mieloproliferative BCR-ABL-negative.
Bibliografie
1. Baxter EJ, Scott LM, Campbell PJ, East C, Fourouclas N, Swanton S, et al. Mutația dobândită a tirozin-kinazei JAK2 în tulburările mieloproliferative umane. Lancet 2005; 365: 1054-61.
2. James C, Ugo V, Le Couedic JP, Staerk J, Delhommeau F, Layout C, et al. O mutație clonală unică a JAK2 care duce la o semnalizare constitutivă cauzează policitemia vera. Nature 2005; 434: 1144-8.
3. Kralovics R, Passamonti F, Buser AS, Teo SS, Tiedt R, Passweg JR, et al. O mutație de câștig de funcție în JAK2 este frecvent întâlnită la pacienții cu tulburări mieloproliferative. N Engl J Med 2005; 352: 1779-90.
4. Levine RL, Waldleigh M, Cools J, Ebert BL, Werning G, Huntly BJ, et al. Mutație de activare în tirozin kinaza JAK2 în policitemia vera, trombocitemia esențială și metaplazia mieloidă cu mielofibroză. Cancer Cell 2005; 7: 387-97.
6. Vainshenker W, Constantinescu SN. O mutație de activare unică în JAK2 (V617F) se află la originea policitemiei Vera și permite o nouă clasificare a bolilor mieloproliferative. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2005; 195-200.
7. Sambrook J, Russell DW. Clonarea moleculară: un manual de laborator. 3 ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 2001.
8. Tefferi A, Pardanani A. Depistarea mutațiilor pentru JAK2V617F: când să se solicite testul și cum să se interpreteze rezultatele. Leuk Res 2006; 30(6): 739-44.
9. James C, Delhommeau F, Marzac C, Teyssandier I, Couedic JP, Giraudier S, et al. Detectarea JAK2 V617F ca test de diagnostic de primă intenție pentru eritrocitoză. Leukemia 2006; 20: 350-3.
10. Campbell PJ, Scott LM, Buck G, Wheatley K, East CL, Marsden JT, et al. Definirea subtipurilor de trombocitemie esențială și relația cu policitemia vera pe baza statutului mutației JAK2 V617F: un studiu prospectiv. Lancet 2005; 366: 1945-53.
11. Antonioli E, Guglielmelli P, Pancrazzi A, Bogani C, Verrucci M, Ponziani V, et al. Implicații clinice ale mutației JAK2 V617F în trombocitemia esențială. Leukemia 2005; 19: 1847-9.