PMC

Această prelegere se bazează pe o recenzie recentă.

Creșterea poverii diabetului la nivel mondial este bine cunoscută, iar efectele asupra costurilor asistenței medicale și asupra suferinței umane, morbidității și mortalității vor fi resimțite în primul rând în națiunile în curs de dezvoltare, inclusiv India, China și țările din Africa. Noi medicamente sunt dezvoltate într-un ritm rapid, iar în ultimii ani au apărut mai multe clase noi de compuși pentru tratamentul diabetului, de exemplu, mimeticele peptidelor asemănătoare glucagonului (GLP-1), inhibitorii dipeptidil-peptidazei-4 (DPP-4), inhibitorii transportorului de sodiu al glucozei-2 (SGLT2). Noile tratamente chirurgicale au devenit, de asemenea, din ce în ce mai disponibile și susținute ca terapii eficiente pentru diabet. Operația de restricție gastrică, operația de bypass gastric, transplantul simultan de pancreas și rinichi, transplantul de pancreas și de insule, toate au fost introduse în ultimii ani. Pentru a evita trauma unei operații majore, au existat numeroase studii privind transplantul de insule izolate prelevate dintr-un pancreas cadaveric. A existat o încurajare din partea „protocolului Edmonton” descris de Shapiro și colegii săi în New England Journal în 2000. Insuleletele au fost injectate în vena portală, iar pacienții, în special cei care sufereau de o periculoasă și inconștientă hipoglicemie, au fost tratați înainte de a dezvolta complicații grave ale diabetului, în special complicații renale. În timp ce primele rezultate au fost promițătoare, aproximativ 70% dintre pacienți neavând nevoie de injecții de insulină după doi ani, la cinci ani, majoritatea acestor pacienți s-au deteriorat și au avut nevoie de suplimente de insulină, în ciuda faptului că unii dintre ei au primit mai mult de un transplant de insule. În seriile mai recente de pacienți, grupul din Edmonton a raportat rezultate mai bune pe termen lung cu utilizarea anticorpului monoclonal antiinfocitar, Campath 1H administrat ca agent de inducție, 45% dintre pacienți fiind independenți de insulină la cinci ani, iar 75% dintre ei aveau detectabila C-peptidă.

Cu toate acestea, pancreasul cadavaric și insulele concurează pentru aceeași sursă și sunt limitate ca număr, astfel că niciunul dintre cele două tratamente nu ar putea fi oferit cu ușurință marii majorități a pacienților diabetici. Unii au încercat să utilizeze o sursă alternativă, de exemplu, insulițe încapsulate de la porci nou-născuți sau adulți. Aceasta este încă foarte experimentală și va fi o alternativă îndepărtată, cu multe obstacole tehnice și, posibil, etice de depășit.

Mai recent, odată cu succesele înregistrate în dezvoltarea de celule stem adulte pluripotente (de la Yamanaka, distins cu premiul Nobel pentru medicină în 2012 pentru dezvoltarea celulelor stem pluripotente induse – iPSC), s-au încercat noi abordări pentru a căuta o metodă care să fie mai accesibilă și mai disponibilă. Inițial, multe speranțe au derivat din cercetările cu celule stem embrionare (CSE), deoarece aceste celule pot fi convinse să se înmulțească și să se dezvolte în orice țesut, însă procesul a fost costisitor, iar problema formării de teratome din aceste celule stem s-a dovedit extrem de dificil de depășit. Mulți dintre factorii importanți legați de dezvoltarea fetală nu sunt înțeleși și nu pot fi reproduși. Cu toate acestea, s-au făcut unele progrese și (ocazional) celulele au fost convinse să secrete insulină, dar, până în prezent, au existat foarte puține aplicații terapeutice.

Științii sunt acum conștienți de faptul că a convinge o celulă să producă insulină este doar un pas în ceea ce poate fi o călătorie lungă și dificilă. Celulele insulare sunt extrem de specializate pentru a avea nu doar o eliberare bazală de insulină, ci și pentru a răspunde rapid la schimbările în concentrația de glucoză din sânge. În cazul insulinei, procesul și reglarea opririi secreției este la fel de important ca și pornirea secreției.

Au fost făcute o varietate de abordări cu puncte de plecare diferite. Celula stem se reproduce singură și poate apoi să se dividă și asimetric și să formeze un alt tip de celulă: Acest lucru este cunoscut sub numele de diferențiere. Deși inițial se credea că acestea sunt disponibile doar de la embrioni, celulele stem neembrionare pot fi acum obținute fără prea multe dificultăți din țesuturi neonatale, din cordonul ombilical și, de asemenea, dintr-o varietate de țesuturi adulte, inclusiv din măduva osoasă, piele și grăsime. Aceste celule stem pot fi extinse și diferențiate, dar repertoriul lor este limitat în comparație cu cel al celulelor stem embrionare: celule stem embrionare oligo- sau pluri- spre deosebire de celulele stem embrionare toti-potente. Chiar mai mult, recent, a existat un mare interes pentru procesul de trans-diferențiere celulară directă, în care o celulă angajată și complet diferențiată, de exemplu o celulă hepatică, este transformată direct într-un alt tip de celulă, de exemplu o celulă beta de insuliță, fără inducerea de-diferențierii înapoi la un stadiu de celulă stem.

Yamanaka, în 2006, a reușit să producă celule stem pluripotente din culturi de fibroblaste neonatale și adulte de șoarece prin adăugarea unui cocktail de patru factori definiți. Acest lucru a dus la o serie de alte studii care au dezvoltat procesul, care s-a dovedit a fi repetabil atât cu țesut uman, cât și cu șoareci de laborator. Utilizarea celulelor iPS a evitat constrângerile etice legate de utilizarea embrionilor umani, dar au existat în continuare alte probleme și obstacole. Au apărut rapoarte privind celulele iPS care devin antigenice pentru o gazdă autologă sau izologă, iar celulele pot acumula anomalii ale ADN-ului și chiar pot păstra memoria epigenetică a tipului de celule de origine și, astfel, au tendința de a se întoarce înapoi. La fel ca și celulele stem embrionare, celulele iPSC pot forma teratome, mai ales dacă diferențierea nu este completă.

În ciuda acestui fapt, s-a reușit foarte puțin să se dirijeze diferențierea celulelor iPSC pentru a forma celule beta din insule în cantitate suficientă care să secrete și să oprească secreția ca răspuns la modificări ale nivelului de glucoză din sânge.

O altă abordare care a fost încercată este combinarea terapiei genice cu celulele stem. S-au înregistrat unele progrese în încercarea de a exprima gena insulinei dorite în celule nediferențiate mai primitive, prin convingerea celulelor stem cu factori de diferențiere in vitro și apoi prin transfecția directă a genei folosind plasmide sau un vector viral. Noi, ca și alții, am folosit o construcție de genă de insulină umană și am introdus-o ex vivo sau in vivo în celule prin electroporare directă (în celulele ex vivo, evident) sau prin vectori virali. Adenovirusul, virusul adeno-asociat și diversele retrovirusuri au fost cele mai studiate, în special Lentivirusul. Cu toate acestea, orice tip de inginerie genetică trezește temeri nu numai de infecție din partea virusului, ci și de demascarea onco-genelor, ceea ce duce la malignizare, și există reglementări stricte cu privire la modul în care se procedează pentru a evita aceste riscuri.

Noi am fost interesați de celulele stem din cordonul ombilical și de celulele stem mezenchimale ca ținte pentru terapia combinată cu celule stem și terapie genică. Aceste celule pot fi obținute într-un mod rezonabil de ușor și reproductibil din cordonul ombilical, altfel aruncat, sau din măduva osoasă ușor accesibilă, selectând celulele cu ajutorul diferitelor tehnici standard. Grăsimea, amnionul și sângele din cordonul ombilical sunt, de asemenea, surse din care se pot obține celule stem mezenchimale. După o fază proliferativă, celulele capătă un aspect asemănător cu un covor de fibroblaste, care se pot diferenția în celule osoase, cartilaginoase sau adipoase. Deși celulele stem mezenchimale provenite din diversele surse menționate pot avea un aspect similar, potențialul lor de diferențiere este idiosincratic și diferă, ceea ce face nepotrivită și dificilă considerarea lor ca fiind o sursă uniformă de celule țintă. Celulele din amniosul neonatal și celulele din cordonul ombilical au o imunogenitate scăzută și nu exprimă antigeni HLA clasa II. De asemenea, ele secretă factori care inhibă reacțiile imune, de exemplu, HLA-G solubil. Deși imunogenitatea este redusă în mod semnificativ, acestea nu sunt încă autologe și, prin urmare, rămâne un risc de respingere a alogrefei. Ele au avantajul că ar putea fi multiplicate, congelate și depozitate în număr mare și ar putea fi utilizate la pacienții care au deja nevoie de agenți imunosupresori, de exemplu cei care au suferit un transplant renal.

În Singapore, studiile noastre asupra celulelor amniotice derivate din cordonul ombilical au arătat un oarecare succes în ceea ce privește exprimarea genelor insulinei și glucagonului, dar secreția de insulină in vitro este mică sau inexistentă. Împreună cu transfecția genei insulinei in vitro, după transplantul peritoneal la șoareci diabetici induși de sterptozotocină, s-a înregistrat o oarecare îmbunătățire a nivelului de glucoză. Colegii noștri din Singapore au utilizat un alt model de hepatococite autologe de la porci diabetici induși de streptozotocină. Aceste hepatocite separate au fost transfectate cu succes ex-vivo cu un construct de genă de insulină umană prin electroflorare, iar apoi celulele au fost injectate direct înapoi în parenchimul hepatic prin mai multe injecții separate. Porcii au fost vindecați de diabet timp de până la nouă luni – ceea ce reprezintă o realizare remarcabilă. Deoarece acestea au fost autotransplanturi, nu au fost necesare medicamente imunosupresoare, dar celulele hepatice au fost obținute din biopsii chirurgicale deschise de mari dimensiuni. Această necesitate de îndepărtare chirurgicală a țesutului hepatic ar limita aplicabilitatea sa, dar, cu toate acestea, a fost un bun studiu de validare a conceptului. În contextul diabetului autoimun, riscul de boală recurentă ar putea persista dacă nu ar putea fi definită și eliminată ținta atacului autoimun. În aceste experimente pe porci, s-a utilizat gena insulinei umane cu un promotor EGR-1 care detectează glucoza. Nu a fost implicat niciun virus, iar plasmidul nu se integrează. Diviziunea celulei transfectate ar dilua activitatea genei, dar un număr mare de plasmidă poate fi produs cu costuri reduse. Același grup de lucrători a reușit să transfecteze cu succes celule stem mezenchimale din măduva osoasă cu plasmidul genei insulinei umane, folosind același promotor EGR-1 și electrofurația. Acest lucru a vindecat șoarecii diabetici după injectarea directă intrahepatică și intraperitoneală.

În cele din urmă, ar trebui să existe prudență în interpretarea rezultatelor acestor rapoarte și a altor rapoarte de terapie celulară și genică pentru diabet. In gene transfection and/or transplantation of insulin-producing cells or clusters in the diabetic rodent, there have been many reports in the literature, but only a few of these claims have been reproduced in independent laboratories. We have suggested the need to satisfy „The Seven Pillars of Credibility” as essential criteria in the evaluation of claims of success in the use of stem cell and/or gene therapy for diabetes.

1. Cure of hyperglycemia

2. Response to glucose tolerance test

3. Evidence of appropriate C-peptide secretion

4. Weight gain

5. Prompt return of diabetes when the transfecting gene and/or insulin producing cells are removed

6. No islet regeneration of stereptozotocin-treated animals and no re-generation of pancreas in pancreatectomized animals

7. Presence of insulin storage granules in the treated cells