Rolul speciilor de Candida în diareea asociată cu antibiotice

Abstract

Pentru a evalua cantitativ rolul speciilor de Candida în diareea asociată cu antibiotice (AAD), probe de scaun de la un total de 395 de pacienți și subiecți de control au fost cultivate în mediu de izolare diferențială: 98 de pacienți au avut DAA, 93 de pacienți au luat antibiotice, dar nu au avut diaree (A+D-), 97 de pacienți nu au luat antibiotice, dar au avut diaree (A-D+), iar 107 pacienți au fost subiecți de control (A-D-). În plus, a fost testată producția de aspartil proteinază secretată (Sap). La pacienții AAD, pozitivitatea Candida (77/98) și supracreșterea Candida (62/98) nu au fost diferite față de cele din rândul pacienților A+D- (75/93 și, respectiv, 52/93 , respectiv). Supracreșterea Candida în rândul pacienților A-D+ (40/97, P=.003) a fost mai puțin frecventă decât în rândul pacienților AAD, dar pozitivitatea Candida nu a fost diferită (80/97, P=.612). La subiecții de control, pozitivitatea și supracreșterea Candida au fost mai puțin frecvente decât în toate celelalte grupuri. Producția de Sap nu a fost diferită între pacienții cu DAA și subiecții de control (P=.568 și P=.590, respectiv). Datele indică faptul că un număr ridicat de Candida este mai degrabă un rezultat al tratamentului cu antibiotice sau al diareei decât o cauză a DAA

Mucegaiul oral și esofagita sunt cele mai frecvente manifestări patologice ale infecțiilor cu Candida . Rolul Candida în diareea asociată cu antibiotice (AAD) a fost dezbătut . Concentrațiile fecale ale speciilor de Candida de ⩾105 ufc/mL în scaun au fost considerate ca fiind cauza diareei la pacienții după terapia cu antibiotice. S-a raportat că pacienții care au primit antibiotice fără a dezvolta diaree au avut <105 cfu Candida fungi/mL scaun

Aspartil proteinazele aspartice secretate (Saps) sunt factori de virulență importanți produși de speciile de Candida. Saps sunt implicate în aderența Candida albicans la mucoasa umană și în invazia țesuturilor umane. O corelație între expresia Saps și virulența Candida a fost demonstrată în cazul candidozei orale și al vaginitei cu Candida la pacienții infectați cu virusul imunodeficienței umane (HIV). În AAD legată de Candida, secreția activă mediată de o toxină fungică sau de substanțe asemănătoare toxinelor a fost discutată ca mecanism patogenetic pentru diaree . La C. albicans au fost identificate 10 gene SAP diferite . La Candida tropicalis a fost observată o slabă activitate proteolitică extracelulară, în timp ce Candida glabrata nu are activitate proteolitică pe agar proteic

C. albicans este cunoscută ca producând aspartil proteinaze atunci când este cultivată într-un mediu cu proteine ca unică sursă de azot , iar expresia genei SAP2 este în principal responsabilă pentru activitatea proteolitică observată la majoritatea tulpinilor care cresc sub formă de drojdie in vitro . Saps prezintă, de asemenea, activitate proteolitică în tractul gastrointestinal; a fost demonstrată expresia SAP în candidoza orală și degradarea mucinei gastrointestinale de către Saps . Degradarea mucinei gastrointestinale de către enzime a fost implicată ca un factor determinant de virulență pentru o serie de enteropatogeni (de exemplu, Vibrio cholerae, speciile Shigella, Helicobacter pylori și Yersinia enterocolitica) . Pentru C. albicans, care colonizează suprafețele mucoaselor, degradarea mucinei de către SAP2 poate permite o apropiere mai strânsă de celulele epiteliale și/sau modificarea suprafețelor celulare . La copiii cu diaree acută și cronică s-au constatat niveluri mai ridicate de proteinază acidă secretorie de Candida decât la subiecții sănătoși de control

Pentru a elucida relevanța patogenetică a speciilor de Candida la pacienții adulți cu DAA, am efectuat culturi de scaun cantitative pentru speciile de Candida la 395 de adulți imunocompetenți. În plus, a fost examinată producția de Saps

Metode

Selecția pacienților și colectarea probelor de scaunToți pacienții dintr-o secție medicală cu 250 de paturi au fost anchetați zilnic, timp de 11 luni, pentru diaree sau pentru tratament cu antibiotice în absența diareei. Diareea a fost definită ca >3 scaune moi sau apoase pe zi . Tratamentul antibiotic a fost definit ca fiind administrarea de antibiotice orale sau intravenoase în doze terapeutice timp de ⩾1 zi. AAD a fost definit ca >3 scaune moi sau apoase pe zi în timpul sau până la 2 luni după tratamentul cu antibiotice . Pacienții au fost recrutați consecutiv în 4 grupuri de studiu până la atingerea numărului prestabilit necesar pentru comparație statistică (a se vedea analiza statistică de mai jos). Pacienții au fost incluși o singură dată în timpul internării lor în spital

Eșantioanele de scaun de la toți pacienții cu diaree au fost cultivate pentru agenți patogeni bacterieni (salmonella, shigella, yersinia și campylobacter) pe agar selectiv, au fost examinate pentru ovule și paraziți și au fost testate pentru Clostridium difficile prin cultură pe agar selectiv și prin utilizarea testului rapid C. difficile (BD). Pacienții cu oricare dintre acești agenți patogeni au fost excluși din studiu. Astfel, 395 de pacienți (195 cu diaree și 200 fără) au fost incluși în studiu și au fost repartizați în 4 grupuri: (1) grupul A+D+, 98 de pacienți cu DAA care au primit antibiotice și au prezentat diaree; (2) grupul A+D-, 93 de pacienți care au primit antibiotice, dar nu au prezentat diaree; (3) grupul A-D+, 97 de pacienți care nu au primit antibiotice, dar au prezentat diaree; și (4) grupul A-D-, 107 subiecți de control care nu au primit antibiotice și nu au prezentat diaree

Cele 4 grupuri nu au fost diferite în ceea ce privește distribuția pe sexe și vârste. Probele de scaun de la toți subiecții au fost recoltate imediat după o mișcare intestinală și au fost aduse la laboratorul din aceeași clădire în termen de 15 min. Probele de scaun eliminate în timpul nopții au fost păstrate la 4°C și au fost procesate în dimineața următoare

Culturi de candidoză și frotiuri de lamăProbele de scaun au fost diluate la 1:10 cu soluție salină, au fost agitate într-un omogenizator de scaun și din nou au fost diluate la 1:1000 și 1:10000 cu soluție salină. O sută de microlitri din fiecare diluție a fost transferată pe un Candida CHROMagar (BBL) și a fost placată uniform cu un tampon steril. După incubare la 37°C timp de 48 h în aer ambiant, coloniile de Candida au fost numărate și clasificate ca fiind C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis sau alte specii de Candida, în funcție de culoarea coloniilor. Un număr de colonii ⩾105 ufc/mL de scaun a fost clasificat drept „supracreștere de Candida”, în conformitate cu Danna et al. . Un frotiu de lamă din fiecare diluție a primelor 100 de probe de scaun consecutive a fost colorat cu colorația Gram și a fost examinat prin microscopie ușoară pentru detectarea prezenței drojdiilor și a leucocitelor

Detecția de SapsConsecutive izolate de Candida din grupurile de pacienți A-D- și A+D+ au fost testate pentru secreția de aspartil proteinaze în agar de albumină serică bovină (BSA) (1,17% bază carbonică de drojdie , 0,01% extract de drojdie , și 0,2% BSA ), așa cum este descris în altă parte . Mediul a fost ajustat la pH 5,0, a fost sterilizat prin filtrare (dimensiunea porilor, 0,2 μm) și a fost adăugat la o soluție stoc de agar autoclavizat (2%). Proteoliza, care indică activitatea enzimatică, a fost măsurată în milimetri și a fost notată așa cum se sugerează în altă parte : – sau ± (nu a fost prezentă nicio clarificare vizibilă sau o clarificare foarte limitată a agarului în jurul coloniei), 1+ (s-a observat o proteoliză apreciabilă) și 2+ (clarificarea agarului a depășit cu mult marginea coloniei). Tulpina C. albicans SC5314 și un mutant nul SAP2 (furnizat de B. Hube, Universitatea din Hamburg, Germania) au fost investigate ca martori

Analiză statisticăNumărul de pacienți cu număr diferit de Candida în diferite grupuri a fost comparat prin utilizarea testului χ2, iar numărul de drojdii de pe frotiurile de lamele a fost corelat cu numărul de Candida din culturi prin utilizarea corelației lui Pearson. Diferențele în ceea ce privește producția de Sap au fost calculate prin utilizarea testului t al lui Student și a testului exact al lui Fisher. Mărimea eșantionului pentru testul de cultură a fost calculată ca fiind de 91 de pacienți evaluabili, iar pentru testul Sap, a fost calculată ca fiind de 20 de pacienți evaluabili pe grup, cu un α de 0,05 și o putere de 0,8 (SigmaStat, versiunea 2.0; Jandel Scientific). Diferențele cu P<.05 au fost considerate ca fiind semnificative

Rezultate

Culturi Candida și frotiuri de lamăRezultatele culturilor Candida sunt prezentate în figura 1. În grupul A+D+, pozitivitatea Candida (la 77/98 pacienți) și supracreșterea Candida (la 62/98 pacienți) nu au fost semnificativ diferite de cele din grupul A+D- (75/93 pacienți și, respectiv, 52/93 pacienți , respectiv). În grupul A-D+, supracreșterea Candida a fost semnificativ mai puțin frecventă decât în grupul A+D+ (P=.003), dar pozitivitatea Candida nu a fost semnificativ diferită (P=.612). Pozitivitatea și supracreșterea Candida au fost semnificativ mai puțin frecvente în grupul A-D- decât în toate celelalte grupuri (pozitivitatea Candida: 66/107 pacienți, P=.013, comparativ cu grupul A+D+; P=.005, comparativ cu grupul A+D-; și P=.002, comparativ cu grupul A-D+; supracreșterea Candida: 15/107 pacienți, P<.001, comparativ cu toate celelalte grupuri; figura 1)

Analizele exploratorii care utilizează diferite praguri pentru definirea supracreșterii Candida (103, 104, 106 sau 107 cfu/mL scaun) au dat rezultate calitativ similare. În toate calculele, supracreșterea Candida a fost semnificativ mai puțin frecventă în grupul A-D- decât în toate celelalte grupuri. C. albicans a fost cel mai frecvent izolat (216 din 395 de pacienți), urmat de C. glabrata (104 din 395 de pacienți), C. tropicalis (21 din 395 de pacienți), C. krusei (11 din 395 de pacienți) și alte specii de Candida (97 din 395 de pacienți). Culturi mixte de Candida au fost găsite la 122 (31%) din 395 de pacienți. Numărătoarea drojdiilor pe frotiuri de lamă nu s-a corelat cu numărătoarea din culturi (r=.27; figura 2)

Rezultatele activității proteolitice pe agar BSAÎn total, 23 izolate A+D+ și 20 izolate A-D-Candida au fost testate pentru activitatea proteolitică în agar BSA. Activitatea medie±SD a fost de 1,26±1,06 mm pentru grupul A+D+ și de 1,42±0,64 mm pentru grupul A-D-. Dintre cele 23 de izolate A+D+, 16 au avut un scor de proteoliză de 1+ (zonă de clarificare de 1-2 mm) și 1 a avut un scor de 2+ (zonă de clarificare de 3-5 mm), ambele indicând prezența unei activități enzimatice de proteoliză. Dintre cele 20 de izolate A-D-, 17 au avut un scor de proteoliză de 1+ și 2 au avut un scor de 2+. Toate izolatele de C. albicans au prezentat zone de clarificare pe mediul BSA (⩾1 mm, scor ⩾1+). În grupul A-D-, 1 izolat de C. tropicalis nu a prezentat proteoliză. În grupul A+D+, 5 izolate de C. glabrata și 1 izolat de C. tropicalis nu au prezentat proteoliză. Zonele de clarificare din grupul A-D- și A+D+ nu au fost semnificativ diferite atunci când au fost măsurate fie în milimetri (P=.568, testul t al lui Student), fie cu sistemul de notare 1+/2+ (P=.294 și P=.590 pentru izolatele care au obținut scorul 1+ și, respectiv, 2+, testul exact al lui Fisher) . Atunci când izolatele de C. glabrata (despre care se știe că sunt negative pe agarul proteic) au fost eliminate, nu a existat nicio diferență semnificativă în ceea ce privește producția de Sap între grupuri (P=.347)

Discuție

S-a emis ipoteza că o creștere excesivă a candidei ar putea cauza AAD . Am investigat prezența și cantitatea de specii de Candida la pacienții suspectați de AAD, la pacienții fără diaree, dar care iau antibiotice, la pacienții cu diaree, dar care nu iau antibiotice, și la pacienții fără diaree și care nu iau antibiotice (subiecți de control). O proporție semnificativ mai mare de probe de scaun de la pacienții care primeau terapie antimicrobiană și prezentau diaree (grupul A+D+) au fost pozitive pentru speciile de Candida și au avut un număr mai mare de colonii decât probele de la subiecții de control (grupul A-D-). Într-un studiu realizat de Danna și colab. , creșterea excesivă a Candida (⩾105 ufc/mL scaun) a fost observată la 7 (29%) din 24 de pacienți cu DAA. În acel studiu, 0 din 24 de pacienți fără diaree, dar care primeau antibiotice, au avut o supracreștere de Candida . Cu toate acestea, în studiul nostru, 52 (56%) din 93 de pacienți cu antibiotice, dar fără diaree, au avut o creștere excesivă a Candida și nu s-a observat nicio diferență, în comparație cu pacienții AAD. Deoarece am investigat un număr de aproape 4 ori mai mare de pacienți (93 vs. 24), diferențele dintre constatările noastre și cele ale lui Danna et al. se pot datora mărimii mai mari a eșantionului din studiul nostru

Pentru a evalua influența diareei asupra numărului de Candida intestinale, am investigat, de asemenea, pacienții care nu au primit tratament cu antibiotice, dar care au avut diaree (grupul A-D+). În acest grup, creșterea excesivă a Candida (⩾105 ufc/mL scaun) a fost semnificativ mai puțin frecventă decât la pacienții cu AAD, dar pozitivitatea Candida nu a fost semnificativ diferită. Studiile anterioare au arătat că flora normală a scaunelor a fost semnificativ diminuată la pacienții AAD. În studiile în care au fost investigate efectele antibioticelor cu spectru larg asupra compoziției microflorei intestinale la om, s-a observat o corelație inversă semnificativă între logul creșterii maxime a drojdiilor și logul scăderii maxime a anaerobilor . Deoarece am constatat o pozitivitate crescută a Candida la pacienții AAD, pacienții A+D- și pacienții A-D+, sugerăm că scăderea numărului de bacterii din scaune, datorată fie terapiei cu antibiotice, fie diluției în diaree, a permis speciilor de Candida să se extindă, ceea ce a dus la creșterea numărului de Candida pozitive

În studiul nostru, numărul mediu de drojdii de pe frotiurile colorate cu colorația Gram nu s-a corelat cu culturile de Candida atunci când a fost calculat fie cu numărul total de drojdii de pe frotiurile de lamă (r=.27) sau cu indicele sugerat de Danna et al. (r=.12). Discrepanța dintre numărul mare de celule asemănătoare drojdiei numărate la microscopul optic și creșterea slabă sau absentă a speciilor de Candida a fost raportată în altă parte 15]. În acel studiu, autorii au presupus că o mare majoritate a drojdiilor din fecale detectate la microscop nu erau vii . Rezultatele noastre au indicat că trebuie să se manifeste o mare prudență în interpretarea probelor de scaun de la pacienții cu DAA și pozitive pentru speciile de Candida. Utilitatea analizei scaunelor pentru numărarea Candida prin cultură sau frotiuri de lamele la acești pacienți este serios pusă sub semnul întrebării. Absența leucocitelor în probele colorate cu colorația Gram a fost în concordanță cu constatările anterioare . Rezultatele noastre au confirmat, de asemenea, că speciile de Candida făceau parte din flora intestinală normală

Secreția activă mediată de o toxină fungică sau de substanțe asemănătoare toxinelor a fost discutată ca mecanism pentru DAA legată de Candida . Deoarece Saps sunt principalii factori de virulență în infecțiile cu Candida , am investigat aceste proteinaze in vitro. Până în prezent, au fost identificate 10 gene SAP diferite în C. albicans . Deoarece s-a raportat că Sap contribuie la deteriorarea țesuturilor într-un model de candidoză orală umană , aceste proteinaze pot afecta, de asemenea, celulele epiteliale intestinale. Dar la 8 pacienți suspectați de AAD legată de Candida, nu au existat dovezi de colită sau leziuni celulare

În studiul nostru, toate tulpinile de C. albicans investigate au produs Sap, și nu a existat nicio diferență semnificativă între cantitatea de Sap produsă în izolatele de Candida de la pacienții cu AAD și subiecții de control. La copiii cu diaree acută și cronică s-au găsit niveluri mai mari de proteinaze acide secretorii de Candida decât la subiecții sănătoși de control . Deși nivelurile de Sap calculate pentru întregul grup de copii cu diaree acută sau cronică au fost semnificativ mai mari decât nivelurile la subiecții de control, acest lucru nu a fost valabil pentru cazurile individuale. Din 9 izolate de Candida, 4 de la subiecți de control (copii fără diaree) au avut niveluri de Sap comparabile cu cele ale copiilor cu diaree cronică, iar 2 din 9 subiecți de control au avut niveluri comparabile cu cele ale copiilor cu diaree acută. În ciuda acestor niveluri ridicate de Sap, subiecții de control nu au avut diaree. Acest lucru contrastează cu constatările din studiile anterioare, în care producția de Sap la pacienții simptomatici a atins întotdeauna niveluri mai ridicate decât la subiecții de control: Producția de Sap de către speciile de Candida de la pacienții cu vaginită a depășit întotdeauna producția de Sap de către Candida de la purtători, iar tulpinile de Candida din candidoza orală la pacienții cu SIDA au produs de ∼8 ori mai mult Sap decât izolatele de la subiecții de control

Producția de Sap este indicată în mod coerent prin testul BSA agar și ELISA . Mai mult, nivelurile ridicate de Sap secretate in vitro și detectate prin BSA agar sau ELISA s-au corelat cu niveluri crescute de Sap in vivo (de exemplu, în fluidele vaginale de la pacienți cu vaginită HIV-pozitivi) . Se poate specula că speciile de Candida produc temporar niveluri ridicate de Sap in vivo, dar își pierd această capacitate din cauza, de exemplu, a subculturilor. La C. albicans izolată din cavități bucale, s-a demonstrat că producția ridicată de Sap este o caracteristică stabilă. Pe de altă parte, izolatele de C. albicans cu o producție scăzută de proteinaze au prezentat o producție stabilă, de nivel scăzut de Sap la subculturi repetate

În concluzie, rezultatele studiului nostru nu confirmă mecanismele patogenetice sugerate anterior ale DAA legate de Candida . Datele noastre indică faptul că numărul ridicat de Candida este mai degrabă un rezultat al tratamentului cu antibiotice sau al diareei în sine decât o cauză a DAA. Producția principalului factor de virulență fungică Sap la pacienții cu DAA nu a fost diferită de cea a subiecților de control, ceea ce indică faptul că această toxină fungică nu poate fi responsabilă de DAA la adulți. Alți factori de virulență fungică (de ex. phospholipases) warrant further investigation