Långsiktig förbättring av skelettmuskelmassa och styrka genom enkel genadministrering av myostatinhämmare
Resultat och diskussion
AAV-medierad genleverans till muskler ger ett system för att generera höga nivåer av protein i målvävnaden eller genom en utsöndrad produkt som transporteras till avlägsna platser genom cirkulationen (19). Vi klonade de kända sekretade myostatinhämmande generna, inklusive tillväxt- och differentieringsfaktorassocierat serumprotein-1 (GASP-1) (18), follistatinrelaterad gen (FLRG) (17) och follistatin-344 (FS) (13) i AAV-serotyp 1, som har visat sig ha hög muskeltransduktionsförmåga. Det finns två isoformer av follistatin som genereras genom alternativ splicing. Varianten FS-344 genomgår peptidklyvning för att generera isoformen FS-315 och den andra varianten FS-317 producerar isoformen FS-288 efter peptidklyvning. Vi använde den humana varianten FS-344, som uteslutande genererar den serumcirkulerande isoformen FS-315 av FS och innehåller en C-terminal sur region (20). Vi valde FS-344 (FS) eftersom den andra FS-317-isoformen, som saknar C-terminus, uppvisar preferentiell lokalisering till äggstockarnas follikelvätska och hög vävnadsbindningsaffinitet genom heparinsulfatproteoglykaner, vilket kan påverka reproduktionsförmågan och binda till andra off-target-platser (21). FS-288 representerar den membranbundna formen av follistatin (22), är en potent suppressor av hypofysens follikelstimulerande hormon (23), finns i follikelvätskan i äggstocken och i testiklarna och uppvisar hög affinitet för granulosacellerna i äggstocken.
Vi försökte fastställa effekten av dessa proteiner för att öka muskelmassan hos normala och dystrofa möss. Vi administrerade 1 × 1011 AAV1-viruspartiklar per djur som kodar för FS, FLRG, GASP-1 eller GFP bilateralt i quadriceps- och tibialis anterior-musklerna hos fyra veckor gamla C57BL/6-möss av vildtyp. Alla djur som behandlades med myostatinhämmare uppvisade en ökning av kroppsmassan med en observerbar grov förstärkning av musklerna när de analyserades vid 725 dagars ålder jämfört med GFP-behandlade kontroller (fig. 1 a och b). Utvärdering av individuella muskelvikter visade en ökning av muskelmassan för alla myostatinhämmare behandlade djur, med den största ökningen hos FS-behandlade djur. Den ökade muskelmassan återfanns i de injicerade bakbensmusklerna och i muskler som låg långt från injektionsstället, t.ex. triceps. Dessa hämmare utsöndrades alltså i cirkulationen från muskelinjektionsstället, vilket ökade skelettmuskelmassan på avlägsna ställen (fig. 1 c). Den ökade muskelmassan åtföljdes av en funktionell förbättring som visade sig genom en ökning av greppstyrkan i bakbenen (fig. 1 d). Det fanns ingen effekt på hjärtmassan eller kardiomyocyternas histologiska utseende, vilket tyder på att myostatinhämningen var selektiv för skelettmuskelvävnad (data visas inte). Det har funnits farhågor om att FS har en negativ inverkan på gonadfunktionen. Vi fann ingen förändring av reproduktionsförmågan hos möss som behandlades med vår AAV1 med FS344-transgenen (AAV1-FS, tabell 1). Dessutom fann vi inga histologiska/patologiska förändringar i gonadvävnaden hos FSbehandlade möss jämfört med kontrollerna (data inte visad).
Myostatinhämmande proteiner ökar muskelmassan och muskelstyrkan hos C57BL/6-möss av vildtyp. (a) Bruttomuskelmassan i bakbenen ökar hos alla myostatininhibitorproteinbehandlade möss vid 725 dagars ålder jämfört med AAV1-GFP-injicerade kontroller. (b) Den totala kroppsmassan är signifikant ökad hos AAV1-FS-injicerade (**, P ≤ 0,01) och AAV1-GASP-1-injicerade (*, P ≤ 0,05) möss jämfört med AAV1-GFP-kontroller vid 725 dagars ålder (n = 10). (c) Massan av enskilda bakbens- och frambensmuskler ökar hos möss som injicerats med AAV som uttrycker myostatinhämmande proteiner (n = 10). *, P ≤ 0.05. (d) Greppstyrkan i bakbenet förbättras >2 år hos alla behandlade möss med de största skillnaderna hos AAV1-FS behandlade djur jämfört med AAV1-GFP-kontroller (n = 10). Felstaplar representerar standardfel.
- Se inline
- Se popup
Reproduktionen var normal hos djur som behandlades med AAV1-FS
Med tanke på de robusta effekterna av FS-tillförsel testade vi härnäst potentialen för AAV1-FS som levererades postnatalt i ett kliniskt meningsfullt paradigm för att öka muskelmassan och muskelstyrkan och fördröja muskelförsämringen i mdx-musmodellen av Duchennes muskeldystrofi (DMD). DMD är en X-bunden recessiv sjukdom som leder till att skelettmuskulaturen och hjärtfunktionen försämras, vilket i slutändan leder till döden. Nyligen undersöktes FS i mdx-djur som överuttrycker en duplicerad domän av follistatingenen. Resultaten visade ökad muskelmassa och dämpad patologi, även om resultaten endast dokumenterades till 15 veckors ålder (24). I våra studier injicerades mdx-djur bilateralt i quadriceps- och tibialis anterior-musklerna med en låg (1 × 1010 viruspartiklar) eller hög dos (1 × 1011 viruspartiklar) AAV1-FS vid 3 veckors ålder och följdes i 5 månader före obduktion. Ökade nivåer av cirkulerande FS upptäcktes i serum hos både låg- och högdosbehandlade djur med den höga dosen som uttryckte de största nivåerna av serumdetekterad FS (hög dos, 15,3 ± 2,1 ng/ml; låg dos, 6,8 ± 0,4 ng/ml; GFP-kontroller, 0 ± 0,1 ng/ml; n = 8 per grupp; P < 0,01). Vi visade att AAV1-FS ökade kroppsmassan jämfört med GFP-behandlade kontroller, med den största ökningen i gruppen med hög dos FS (data visas inte). Bruttoobservation av AAV1-FS-behandlade möss visade en signifikant ökning av muskelstorleken jämfört med AAV1-GFP-behandlade djur (fig. 2 a), med den största individuella muskelviktsökningen hos högdos FS-behandlade djur (fig. 2 b). Effekterna var inte begränsade till de injicerade musklerna, utan de fanns även på platser som låg långt från de direkt riktade musklerna (fig. 2 b). Den ökade muskelmassan ledde till en dosberoende förbättring av muskelstyrkan i bak- och frambenen hos behandlade djur jämfört med GFP-behandlade kontroller (fig. 2 c). Histologiska och morfometriska analyser av AAV1-FS-injicerade muskler och på avlägsna platser visade på myofiberhypertrofi, vilket stöder de grova observationer som gjordes vid obduktionstillfället (fig. 3 a-c). Vidare fanns det ingen förändring av muskelfibertyperna hos AAV-FS-behandlade djur; det fanns dock färre totala fibrer per kvadratmillimeter yta i tibialis anterior-muskeln hos djur som behandlades med den höga dosen AAV-FS (fig. 3 d och e). Påfallande nog uppvisade FS-behandlade möss en signifikant minskning av kreatinkinas i serum jämfört med GFP-behandlade kontroller (fig. 4 a). Detta är av intresse eftersom FS var skyddande trots att det inte korrigerade den underliggande dystrofinbristen. Den exakta mekanismen är inte klar, men man kan spekulera i att en ökning av styrkan hos enskilda fibrer gör dem mindre mottagliga för skador från den stress som normala aktiviteter innebär. Satellitcellernas inblandning i den postnatala myostatinhämningen återstår att lösa helt och hållet; vi såg dock ingen statistisk förändring i muskelns satellitcellsmarkörer för FS-behandlade djur (data visas inte).
Enstaka injektion av AAV1-FS ökar muskelmassan och muskelstyrkan hos unga mdx-möss. (a) Bruttomuskelmassan i bakbenet ökar hos AAV1-FS-injicerade mdx-djur vid 180 dagars ålder jämfört med AAV1-GFP-injicerade kontroller. (b) Massan av enskilda bakbens- och frambensmuskler ökar vid 180 dagars ålder hos möss som vid 3 veckors ålder injicerats med AAV1-FS jämfört med AAV1-GFP-kontroller (n = 15). *, P ≤ 0.05. (c) Greppstyrkan förbättras på ett dosberoende sätt hos unga mdx-möss som injicerats vid 3 veckors ålder med AAV1-FS följt i 180 dagar (n = 15). Rött, högdos AAV1-FS; blått, lågdos AAV1-FS; grönt, AAV1-GFP-kontroller. Felstaplar representerar standardfel.
mdx-möss som behandlas med AAV1-FS vid 3 veckors ålder och följs i 180 dagar uppvisar myofiberhypertrofi. (a) H&E-färgning av tibialis anterior avslöjar myofiberhypertrofi i AAV1-FS-injicerad muskel jämfört med AAV1-GFP-kontrollen. (Ursprunglig förstoring, ×40.) (b) Medeldiametern för mörka (långsamt oxiderande), intermediära (snabbt oxiderande glykolytiska) och ljusa (snabbt glykolytiska) myofibrer i tibialis anterior (markerad med skrafferad linje) är signifikant ökad hos möss som injicerats med AAV1-FS jämfört med AAV1-GFP-injicerade kontroller. (P < 0,001; n = 5). (c) Medeldiametern för intermediära och lätta myofibrer (indikerad av skrafferad linje) i triceps är signifikant ökad hos möss som injicerats med AAV1-FS jämfört med AAV1-GFP-injicerade kontroller. (P < 0,001; n = 5.) (d) Fördelningen av mörka, intermediära och ljusa fibrer som bestäms av färgning med succinidedehydrogenas (SDH) förändras inte av behandling med höga eller låga doser av AAV1-FS. (P > 0,05 mellan alla grupper; n = 5.) (e) Det genomsnittliga antalet fibrer som räknats per en opartisk räkneram på 0,14 mm2 minskar i tibialis anterior hos AAV1-FS-behandlade möss, med tanke på att den genomsnittliga diametern på myofibrerna ökar. (*, P < 0,01; n = 5.) Felstaplar representerar standardfel.
mdx-möss som behandlas med AAV1-FS uppvisar minskade markörer för muskelskador och åldrade mdx-möss reagerar på FS-behandling med funktionella fördelar. (a) Serumkreatinkinasnivåerna (enheter/liter) är minskade 3 månader efter injektion med AAV1-FS jämfört med AAV1-GFP-injicerade kontroller. (*, P < 0,05; n = 10.) Felstaplar representerar standardfel. (b) Greppstyrkan i bakbenet ökar signifikant (P ≤ 0,05) vid 275 dagar och därefter hos åldrade mdx-möss som behandlats med AAV1-FS vid 210 dagars ålder (n = 15). Rött, högdos AAV1-FS; grönt, AAV1-GFP-kontroller. (c) H&E-färgning av åldrad gastrocnemius visar minskad patologi när den injicerades vid 210 dagars ålder med FS jämfört med GFP-injicerade kontroller. (Original förstoring, ×40.) (d) H&E-färgat diafragma hos djur som injicerats vid 210 dagars ålder med FS visar mindre fettutbyte än GFP-injicerade kontroller i sent skede. (Ursprunglig förstoring, ×20.)
Vi utvärderade också potentialen för AAV1-FS att öka muskelstyrkan hos mdx-djur när de behandlas vid högre ålder. Vi fann att AAV1-FS-injektion vid 210 dagars ålder ökade muskelstyrkan ≈60 dagar efter administrering och att den ökade styrkan kvarstod långsiktigt under de 560 dagar som utvärderades i denna studie (fig. 4 b). Redan vid 180 dagars ålder, före AAV1-FS-behandlingen, fanns det uppenbar patologi i musklerna hos obehandlade mdx-djur, med framträdande endomysiell bindvävsproliferation och inflammation (fig. 4 c och d). Patologisk utvärdering av gastrocnemius- och diafragmamuskler vid 560 dagars ålder visade att AAV1-FS-behandlade djur hade betydligt färre fokala grupper av nekrotiska muskelfibrer och infiltrat av mononukleära celler. Viktigt är att AAV1-FS behandlade djur hade betydligt färre fokala områden med endomysiell bindvävsproliferation, som var uttalade hos GFP-behandlade djur, vilket visar att fibros, ett kännetecken för muskeldystrofi, minskade hos FS-behandlade djur (fig. 4 c). Patologin i diafragman visade också att FS-behandlingen minskade inflammation och fettutbyte jämfört med GFP-behandlade djur (fig. 4 d). Vidare visade AAV1-FS-behandlingen signifikanta ökningar av muskelfiberdiametern vid denna ålder jämfört med kontroll GFP-behandlade djur (fig. 4 c och d). Dessa resultat visade att myostatinhämning genom FS-behandling var fördelaktig hos åldrade mdx-djur som hade genomgått flera omgångar av muskeldegeneration och regeneration. Översättning till en klinisk parallell tyder på att AAV-medierad FS-genterapi kan ha potential för den äldre DMD-patienten oberoende av att ersätta den saknade genen och kan ha en potentiell roll i kombinationsterapi liknande den som visats för IGF-1- och minidystrofin-genersättning (25).
Dessa resultat tyder på att hämning av myostatin med FS-344, levererat genom en enda AAV1-injektion, kan öka muskelstorlek och muskelstyrka och tolereras väl i >2 år. Resultaten av FS344 kan erbjuda en mer kraftfull strategi än andra som enbart riktar sig mot myostatin på grund av additiva effekter, t.ex. follistatins inblandning i flera signalvägar, och det senaste fyndet som visar på en minskad inflammation i en modell av endotoxemi (15, 26). Den slående förmågan hos FS att ge en grov och funktionell långsiktig förbättring av dystrofa muskler hos äldre djur motiverar att man överväger dess kliniska utveckling för att behandla sjukdomar i rörelseapparaten, inklusive äldre DMD-patienter.