Strukturní biochemie/regulace enzymů/alosterická regulace
Allosterickou regulací se rozumí typ regulace enzymů zahrnující vazbu nesubstrátové molekuly, známé jako alosterický efektor, na jiných místech enzymu, než je aktivní místo. Název „allo“ znamená jiný a „sterický“ označuje polohu v určitém prostoru. Jinými slovy alosterický znamená „na jiném místě“. Alosterické místo je místo, na kterém malá regulační molekula interaguje s enzymem a inhibuje nebo aktivuje tento konkrétní enzym; což je odlišné od aktivního místa, kde dochází ke katalytické aktivitě. Vazba alosterického efektoru je obecně nekovalentní a reverzibilní. Tato interakce tedy mění tvar enzymu, který následně mění tvar aktivního místa. Tato změna konformace buď inhibuje, nebo zvyšuje katalýzu reakce. Alosterické řízení tedy umožňuje buňce rychle regulovat potřebné látky prostřednictvím inhibice a nebo zesílení.
ATCaseEdit
The enzyme aspartate transcarbamoylase (ATCase) is an allosteric enzyme that catalyzes the first step in the synthesis of pyrimidines.
StructureEdit
ATCase is made of six regulatory subunits and six catalytic subunits. The 3 regulatory subunits (r) are dimers made of 2 chains of 17 kd each. The smaller of the two, the regulatory subunit can bind to CTP and thus shows no catalytic activity. The 2 catalytic subunits (c) are trimers consisting of 3 chains, each 34 kd. The catalytic subunit is unresponsive to CTP thus does not follow a sigmoidal behavior.
- The quaternary structure of ATCase is composed of the two catalytic trimers stacked one on top of another. Inhibiční účinek CTP, stimulační působení ATP a kooperativní vazba substrátů jsou doprovázeny velkými změnami v kvartérní struktuře ATCasy.
- Každý řetězec r každé regulační podjednotky se váže s řetězcem c katalytického trimeru. Oblast kontaktu na mezi r řetězcem a c řetězcem je stabilizována doménou zinku vázanou na histidinové zbytky v r řetězci. Všechny řetězce c mají kontakt s regulační podjednotkou.
Katalytické a regulační podjednotky lze oddělit nejprve přidáním rtuťnaté sloučeniny a poté ultracentrifugací. Sloučeniny rtuti přeruší spojení, protože vytěsní zinečnatý ion, čímž destabilizuje doménu r podjednotky. Reakce se nechová podle Michaelis-Mentenova chování, místo toho vytváří sigmoidální křivku kvůli změnám reakce v koncentraci substrátu prostřednictvím regulace jinými molekulami a změnám pravděpodobnosti vazby. Přidání většího množství substrátu má dva účinky na zvýšení pravděpodobnosti, že enzym naváže více než jednu molekulu substrátu, a zároveň zvyšuje průměrné množství substrátů navázaných na každý enzym. Více substrátu v konečném důsledku zvýhodňuje R-stav ATCasy, protože rovnováha závisí na počtu aktivních míst, která jsou obsazena substrátem, což je zcela opačné než Michaelis-Mentenovo chování.
KineticsEdit
Allosterické enzymy vykazují spíše sigmoidální kinetiku než Michaelisovu-Mentonovu kinetiku. Je to proto, že enzym osciluje mezi dvěma odlišnými konformačními stavy, podobně jako hemoglobin.
- Stav T je charakterizován nízkou afinitou k substrátu a nízkou katalytickou aktivitou.
- V konformaci stavu R dochází k oddělení 12Å mezi katalytickými trimery a zhruba 10° rotaci kolem centrální osy. Rovněž dochází k zhruba 15° rotaci regulačních podjednotek. Konformace ve stavu R je charakterizována zvýšením koncentrace substrátu a současně zvýšením reaktivity ATCázy při přípravě na enzymatickou cestu výroby CTP.
Alosterická aktivaceEdit
Po navázání substrátu na aktivní místo umístěné v kapse mezi řetězci c v trimeru má ATCáza větší pravděpodobnost posunu do stavu R díky vazbě substrátu stabilizující stav R. Vazba substrátů posouvá rovnováhu více ke stavu R tím, že zvyšuje pravděpodobnost
že se každý enzym naváže, a zvyšuje průměrný počet navázaných substrátů (kooperativita).
ATP se může také vázat na regulační místo ATCasy, ale ATP neinhibuje aktivitu ATCasy, ve skutečnosti ATP aktivitu ATCasy zvyšuje. Takže při vysokých hladinách ATP může ATP působit jako konkurent,pro regulační místo, proti CTP. Aktivita ATCase se tedy může se zvýšenou koncentrací ATP zvýšit. Toto zvýšení aktivity může mít potenciální fyziologické vysvětlení. Vysoká hladina ATP znamená, že je vysoká koncentrace purinových nukleotidů, takže zvýšená aktivita ATCasy zvýší koncentraci pyrimidinů. Koncentrace purinů i pyrimidinů tak bude vyrovnanější. Mít v buňce hodně ATP také znamená mít energii pro procesy, jako je syntéza mRNA a také replikace DNA, takže ATCáza může zvýšit množství pyrimidinů, které pak mohou být využity v těchto procesech.
PALAEdit
V přítomnosti N-(fosfonacetyl)-L-asparátu (PALA), analogu bisubstrátu, který se podobá meziproduktu substrátu na enzymatické dráze, inhibuje PALA ATCázu, která se váže na aktivní místa. Inhibice však odhalila změnu kvartérní stuktury při vazbě PALA. Dva katalytické trimery jsou izolovány do příslušných T a R stavů. Tato inhibice není alosterická, ale naopak zavádí katalytické podjednotky, které jsou zodpovědné za alosterickou inhibici této kompletní zpětnovazební inhibiční cesty.
Stav T vs. stav RStav T je známý tím, že napíná molekulu, což zvyšuje množství substrátu potřebné k navázání na enzym při 1/2 Vmax (Km). Stav T je méně aktivní a je zvýhodněn vazbou CTP. Vlivem CTP se T-stav stabilizuje. To znamená, že je obtížnější převést enzym do stavu R. Na druhou stranu je známo, že R-stav je uvolněnější a snižuje Km. Se zvyšující se koncentrací substrátu se rovnováha posouvá ze stavu T do stavu R. V R-stavu je molekula aktivnější, což znamená, že vazba substrátu je zvýhodněna. Účinek ATP na stav R spočívá v tom, že je stabilizován, což usnadňuje vazbu substrátů.
Homotropní účinky — účinky substrátu na alosterické enzymy.
Heterotropní účinky —účinky nesubstrátových molekul na alosterické enzymy, například CTP a ATP na ATCasu
Alosterická inhibiceEdit
Cytidin trifosfát (CTP), koncový produkt ATCázy, působí jako alosterický regulátor. Karbamoylfosfát a aspartát kondenzují na meziprodukt N-karbamoylaspartát, který pak tvoří CTP. CTP se váže na r řetězec regulační podjednotky, který není v kontaktu s c řetězci. Vazba CTP stabilizuje stav T a snižuje afinitu k substrátu. I když je vazebné místo na regulační podjednotce vzdálené od katalytické podjednotky, vazba způsobí kvartérní strukturní změny, které podporují stabilizaci stavu T a inhibici. Způsobí tedy posun sigmoidální křivky doprava. Reakce bude probíhat rychle při nízké koncentraci , ale při vyšších koncentracích bude CTP působit jako inhibitor ATCase regulačními nebo alosterickými místy, nikoli aktivními místy. To je příklad negativní zpětné vazby, kdy konečný výsledek ukončí počáteční reakci. Zpětnovazební inhibici CTP na ATCase lze zvrátit pomocí ATP.
Heterotropní účinky — účinky nesubstrátových molekul na enzym
KooperativitaEdit
Rychlost tvorby produktu N-karbamoylaspartátu se zvyšuje s rostoucí koncentrací Aspartátu. Protože má kooperativní charakter, můžete vidět, že jeho křivka má sigmodální rys, což znamená, že vazba substrátu na jedno místo molekuly zvyšuje afinitu ostatních substrátů k vazbě na další vazebná místa molekuly. Sigmodální křivka ATCasy zahrnuje směs dvou Michaelis-Mentenových křivek – jednu s vysokou hodnotou KM (zobrazenou přes stav T), druhou s nízkou hodnotou KM (zobrazenou přes stav R). Vazba substrátu na podjednotku a následná změna všech ostatních podjednotek se nazývá kooperativita. Při kooperativitě vazba v jednom místě zvyšuje nebo snižuje vazbu v jiném místě enzymu. To je způsobeno konformačními změnami sousedních zbytků podjednotky, které ovlivňují změnu tvaru druhé katalytické podjednotky. Tento proces je analogický tomu, jak hemoglobin kooperativně váže molekuly kyslíku.
MechanismEdit
Enzym má dvě aktivní místa. Jedno je pro substrát a druhé pro alosterický aktivátor, který je v regulačním místě. Aktivní místo enzymu nemůže vázat substrát, pokud není alosterický aktivátor navázán na regulační místo. Na druhou stranu, pokud se alosterický aktivátor naváže na enzym, tvar aktivního místa umožňuje navázání substrátu, což umožňuje vznik produktů. Enzym zůstane aktivní, dokud alosterický aktivátor neopustí enzym.