Bioquímica estrutural/Regulação enzimática/Controle alostárico
Controle alostárico refere-se a um tipo de regulação enzimática que envolve a ligação de uma molécula não-substrate, conhecida como o efetor alostárico, em locais sobre a enzima que não o local ativo. O nome “allo” significa outro e “estérico” refere-se a uma posição em um determinado espaço. Em outras palavras, allosteric significa “em outro lugar”. Um local alostérico é um local no qual uma pequena molécula reguladora interage com uma enzima para inibir ou ativar essa enzima específica; que é diferente do local ativo onde ocorre a atividade catalítica. A ligação do efetor alérgico é, em geral, não-vigalente e reversível. Esta interacção altera assim a forma da enzima que, por sua vez, altera a forma do local activo. Esta alteração na conformação inibirá ou aumentará a catálise de uma reacção. Assim, o controle alostérico permite à célula regular rapidamente as substâncias necessárias através da inibição e/ou do aumento.
ATCaseEdit
The enzyme aspartate transcarbamoylase (ATCase) is an allosteric enzyme that catalyzes the first step in the synthesis of pyrimidines.
StructureEdit
ATCase is made of six regulatory subunits and six catalytic subunits. The 3 regulatory subunits (r) are dimers made of 2 chains of 17 kd each. The smaller of the two, the regulatory subunit can bind to CTP and thus shows no catalytic activity. The 2 catalytic subunits (c) are trimers consisting of 3 chains, each 34 kd. The catalytic subunit is unresponsive to CTP thus does not follow a sigmoidal behavior.
- The quaternary structure of ATCase is composed of the two catalytic trimers stacked one on top of another. O efeito inibitório do CTP, a ação estimulante do ATP, e a ligação cooperativa dos substratos são todos acompanhados por grandes mudanças na estrutura quaternária do ATCase.
- Cada cadeia de cada subunidade reguladora se liga com uma cadeia c do trimer catalítico. A região de contato entre a cadeia r e a cadeia c é estabilizada por um domínio de zinco ligado a resíduos de histidina na cadeia r. Todas as cadeias c têm contato com a subunidade reguladora.
As subunidades catalítica e reguladora podem ser separadas adicionando primeiro um composto mercurial e depois por ultracentrifugação. Os compostos mercuriais quebram a conexão porque deslocam o íon Zinco, desestabilizando o domínio r-subunit. A reação não segue um comportamento de Michaelis-Menten, mas produz uma curva sigmoidal por causa das mudanças de resposta na concentração do substrato através da regulação por outras moléculas e das mudanças na probabilidade de ligação. A adição de mais substrato tem dois efeitos no aumento da probabilidade de que a enzima irá ligar mais de uma molécula de substrato enquanto aumenta a quantidade média de substratos ligados a cada enzima. Mais substrato acaba por favorecer o estado R da ATCase, visto que o equilíbrio depende do número de sítios activos que são ocupados pelo substrato, o que é completamente oposto ao comportamento de Michaelis-Menten.
KineticsEdit
As enzimas alósteres exibem cinética sigmoidal ao invés de Michaelis-Cinética Menton. Isto porque a enzima oscila entre dois estados conformacionais distintos, muito parecidos com a hemoglobina.
- O estado T é caracterizado por baixa afinidade do substrato e baixa atividade catalítica.
- Na conformação do estado R, há uma separação de 12Å entre os trimers catalíticos, e uma rotação de aproximadamente 10° em torno do eixo central. Há também uma rotação de 15° pelas subunidades reguladoras. A conformação de estado R é caracterizada por um aumento na concentração do substrato aumentando simultaneamente a reatividade do ATCase em preparação para a via enzimática de produção de CTP.
Ativação AllostáticaEditar
Ligação do substrato de ATCase no local ativo localizado no bolso entre as cadeias c no trimer, ATCase tem uma maior probabilidade de mudar para o estado R devido à ligação do substrato estabilizando o estado R. A ligação de substratos desloca o equilíbrio mais para o estado R, aumentando a probabilidade
de cada enzima se ligar e aumentando o número médio de substratos ligados (cooperatividade).
ATP também pode ligar-se ao sítio regulador da ATCase, mas o ATP não inibe a actividade da ATCase, de facto o ATP aumenta a actividade da ATCase. Assim, em níveis elevados de ATP, o ATP pode agir como um concorrente, para o site regulador, contra o CTP. Portanto, a atividade da ATCase pode aumentar com o aumento da concentração de ATP. Esse aumento na atividade pode ter explicações fisiológicas potenciais. Níveis elevados de ATP significam que há uma alta concentração de nucleotídeos puros, portanto o aumento da atividade da ATCase aumentará a concentração de pirimidinas. Assim, a concentração de purinas e pirimidinas será mais equilibrada. Ter também muito ATP na célula significa ter energia para processos como a síntese de mRNA e também replicação de DNA, assim a ATCase pode aumentar as quantidades de pirimidinas que podem ser usadas nestes processos.
PALAEdit
Na presença de N-(fosfonacetyl)-L-asparate (PALA), um análogo bissubstrato que se assemelha ao substrato intermediário na via enzimática, a PALA inibe a ATCase que se liga aos locais ativos. A inibição, porém, revelou a mudança na estuctura quaternária após a ligação do PALA. Dois trimers catalíticos são isolados em seus respectivos estados T e R. Esta inibição não é alostérica, mas introduz as subunidades catalíticas que são responsáveis pela inibição alostérica desta via completa de inibição de feedback.
estado T vs. estado RO estado T é conhecido por tensionar a molécula que eleva a quantidade de substrato necessária para se ligar à enzima a 1/2 Vmax (Km). O estado T é menos ativo e é favorecido pela ligação CTP. O efeito do CTP é que o estado T se estabiliza. Isto significa que é mais difícil converter a enzima para o estado R. Por outro lado, o R-state é conhecido por ser mais relaxado e diminui o Km. À medida que a concentração do substrato aumenta, o equilíbrio passa do estado T para o estado R. No estado R, a molécula é mais activa, o que significa que a ligação do substrato é favorecida. O efeito do ATP sobre o estado R é que ele é estabilizado, o que facilita a ligação dos substratos.
Efeitos homotrópicos — efeitos do substrato sobre as enzimas alérgicas.
Efeitos heterotrópicos —Os efeitos das moléculas não sulfatadas sobre as enzimas alostóricas como CTP e ATP sobre ATCase
Allosteric InhibitionEdit
Cytidine triphosphate (CTP), o produto final do ATCase atua como um regulador alostático. O fosfato de carbamoyl e o aspartato condensam em N-carbamoylaspartate intermediário que depois forma o CTP. O CTP liga-se à cadeia r da subunidade reguladora que não está em contacto com as cadeias c. A ligação do CTP estabiliza o estado T e diminui a afinidade do substrato. Mesmo que o local de ligação na subunidade reguladora esteja distante da subunidade catalítica, a ligação resultará em mudanças estruturais quaternárias que promovem a estabilização do estado T e a inibição. Assim, ela faz com que a curva sigmoidal mude para a direita. A reação ocorrerá rapidamente a uma baixa concentração de , mas em concentrações maiores, o CTP atuará como inibidor da ATCase por locais regulatórios ou alostóricos, não ativos. Este é um exemplo de feedback negativo, onde o resultado final terminará a reação inicial. A inibição do feedback de CTP no ATCase pode ser revertida pelo ATP.
Efeitos heterotrópicos — efeitos de moléculas não-substrato sobre a enzima
CooperatividadeEditar
A taxa de formação do produto N-carbamoylaspartato aumenta à medida que a concentração de Aspartato aumenta. Como tem caráter cooperativo, você pode ver que sua curva tem a característica sigmodal que significa que a ligação do substrato em um local das moléculas aumenta a afinidade para que os outros substratos se liguem aos outros locais de ligação das moléculas. A curva sigmodial de ATCase incorpora uma mistura de duas curvas de Michaelis-Menten – uma com um alto valor de KM (mostrado através do estado T), a outra com um baixo valor de KM (mostrado através do estado R). A ligação de um substrato a uma subunidade e a conseqüente alteração de todas as outras subunidades é chamada de cooperatividade. Na cooperatividade, a ligação em um local aumenta ou diminui a ligação em outro local da enzima. Isto é devido às mudanças conformacionais dos resíduos das subunidades vizinhas que afetam a mudança na forma da outra subunidade catalítica. Este processo é análogo a como a hemoglobina cooperativamente liga moléculas de oxigênio.
MechanismEdit
A enzima tem dois locais ativos. Um é para o substrato e o outro é para o ativador alérgico que está no local regulador. O local ativo da enzima não pode ligar o substrato quando os ativadores alérgicos não estão ligados ao local regulatório. Por outro lado, se o ativador alérgico se liga à enzima, a forma do local ativo, ele permite que o substrato se ligue permitindo que os produtos sejam produzidos. A enzima permanecerá ativa até que o ativador alérgico deixe a enzima.