Biochemia strukturalna/Regulacja enzymów/Kontrola allosteryczna
Kontrola allosteryczna odnosi się do rodzaju regulacji enzymatycznej obejmującej wiązanie cząsteczki nie będącej substratem, znanej jako efektor allosteryczny, w miejscach na enzymie innych niż miejsce aktywne. Nazwa „allo” oznacza inny, a „steryczny” odnosi się do pozycji w pewnej ilości przestrzeni. Innymi słowy, allosteryczny oznacza „w innym miejscu”. Miejsce allosteryczne to miejsce, w którym mała cząsteczka regulacyjna oddziałuje z enzymem w celu zahamowania lub aktywacji tego konkretnego enzymu; co różni się od miejsca aktywnego, w którym zachodzi aktywność katalityczna. Wiązanie efektora allosterycznego jest na ogół niekowalencyjne i odwracalne. Interakcja ta zmienia więc kształt enzymu, co z kolei zmienia kształt miejsca aktywnego. Ta zmiana konformacji będzie albo hamować, albo wzmacniać katalizę reakcji. Tak więc kontrola allosteryczna pozwala komórce na szybką regulację potrzebnych substancji poprzez inhibicję lub wzmocnienie.
ATCaseEdit
The enzyme aspartate transcarbamoylase (ATCase) is an allosteric enzyme that catalyzes the first step in the synthesis of pyrimidines.
StructureEdit
ATCase is made of six regulatory subunits and six catalytic subunits. The 3 regulatory subunits (r) are dimers made of 2 chains of 17 kd each. The smaller of the two, the regulatory subunit can bind to CTP and thus shows no catalytic activity. The 2 catalytic subunits (c) are trimers consisting of 3 chains, each 34 kd. The catalytic subunit is unresponsive to CTP thus does not follow a sigmoidal behavior.
- The quaternary structure of ATCase is composed of the two catalytic trimers stacked one on top of another. Hamującemu działaniu CTP, stymulującemu działaniu ATP i kooperatywnemu wiązaniu substratów towarzyszą duże zmiany w strukturze czwartorzędowej ATCase.
- Każdy łańcuch r każdej podjednostki regulatorowej łączy się z łańcuchem c trimeru katalitycznego. Region kontaktu pomiędzy łańcuchem r a łańcuchem c jest stabilizowany przez domenę cynku związaną z resztami histydynowymi w łańcuchu r. Wszystkie łańcuchy c mają kontakt z podjednostką regulatorową.
Podjednostki katalityczne i regulatorowe można rozdzielić, dodając najpierw związki rtęciowe, a następnie poddając je ultrawirowaniu. Związki rtęciowe przerywają połączenie, ponieważ wypierają jon cynku, destabilizując domenę podjednostki r. Reakcja nie przebiega zgodnie z zachowaniem Michaelisa-Mentena, zamiast tego wytwarza krzyw± sigmoidaln± z powodu zmian stężenia substratu poprzez regulację przez inne cz±steczki oraz zmian w prawdopodobieństwie wi±zania. Dodanie większej ilości substratu ma dwojaki wpływ na zwiększenie prawdopodobieństwa, że enzym zwiąże więcej niż jedną cząsteczkę substratu, jednocześnie zwiększając średnią ilość substratów związanych z każdym enzymem. Więcej substratu ostatecznie faworyzuje stan R ATCase, ponieważ równowaga zależy od liczby miejsc aktywnych, które są zajęte przez substrat, co jest całkowicie odwrotne do zachowania Michaelisa-Mentena.
KineticsEdit
Allosteryczne enzymy wykazują raczej kinetykę sigmoidalną niż Michaelisa-Mentona. Dzieje się tak, ponieważ enzym oscyluje pomiędzy dwoma różnymi stanami konformacyjnymi, podobnie jak hemoglobina.
- Stan T charakteryzuje się niskim powinowactwem do substratu i niską aktywnością katalityczną.
- W konformacji stanu R, istnieje 12Å separacji pomiędzy trimerami katalitycznymi i około 10° rotacji wokół osi centralnej. Podjednostki regulatorowe również obracają się o około 15°. Konformacja stanu R charakteryzuje się wzrostem stężenia substratu i jednoczesnym zwiększeniem reaktywności ATCase w przygotowaniu do enzymatycznej drogi wytwarzania CTP.
Allosteric ActivationEdit
Po związaniu substratu w miejscu aktywnym zlokalizowanym w kieszeni pomiędzy łańcuchami c w trimerze, ATCase ma większe prawdopodobieństwo przejścia w stan R z powodu wiązania substratu stabilizującego stan R. Wiązanie substratów przesuwa równowagę bardziej w kierunku stanu R poprzez zwiększenie prawdopodobieństwa
że każdy enzym się zwiąże i zwiększenie średniej liczby związanych substratów (kooperatywność).
ATP może również wiązać się do miejsca regulatorowego ATCase, ale ATP nie hamuje aktywności ATCase, a wręcz przeciwnie ATP zwiększa aktywność ATCase. Tak więc przy wysokim poziomie ATP, ATP może działać jako konkurent, dla miejsca regulatorowego, w stosunku do CTP. Tak więc aktywność ATCase może wzrastać wraz ze wzrostem stężenia ATP. Ten wzrost aktywności może mieć potencjalne wytłumaczenie fizjologiczne. Wysoki poziom ATP oznacza wysokie stężenie nukleotydów purynowych, a więc zwiększona aktywność ATCase spowoduje wzrost stężenia pirymidyn. Tak więc stężenie zarówno puryn jak i pirymidyn będzie bardziej zrównoważone. Również posiadanie dużej ilości ATP w komórce oznacza posiadanie energii dla procesów takich jak synteza mRNA, a także replikacja DNA, więc ATCase może zwiększyć ilość pirymidyn, które mogą być następnie wykorzystane w tych procesach.
PALAEdit
W obecności N-(fosfonoacetylo)-L-asparanu (PALA), analogu bisubstratu, który przypomina substrat pośredni na szlaku enzymatycznym, PALA hamuje ATCase, który wiąże się z miejscami aktywnymi. Inhibicja ta ujawniła jednak zmianę struktury czwartorzędowej po związaniu PALA. Dwa trimery katalityczne są izolowane do odpowiednich stanów T i R. Hamowanie nie jest allosteryczne. Ta inhibicja nie jest allosteryczna, ale zamiast tego wprowadza podjednostki katalityczne, które są odpowiedzialne za allosteryczną inhibicję tej kompletnej ścieżki inhibicji zwrotnej.
Stan T vs. stan RStan T jest znany z tego, że napina cząsteczkę, co podnosi ilość substratu potrzebnego do związania się z enzymem przy 1/2 Vmax (Km). Stan T jest mniej aktywny i jest faworyzowany przez wiązanie CTP. Efektem działania CTP jest stabilizacja stanu T. Oznacza to, że trudniej jest przekształcić enzym do stanu R. Z drugiej strony, stan R jest bardziej zrelaksowany i obniża Km. Wraz ze wzrostem stężenia substratu, równowaga przesuwa się ze stanu T do stanu R. W stanie R cząsteczka jest bardziej aktywna, co oznacza, że preferowane jest wiązanie substratu. Wpływ ATP na stan R polega na jego stabilizacji, co ułatwia wiązanie substratów.
Efekty homotropowe — efekty substratowe na enzymy allosteryczne.
Efekty heterotropowe — wpływ substratów na enzymy allosteryczne.Wpływ cząsteczek nie będących substratami na enzymy allosteryczne np. CTP i ATP na ATCase
Allosteric InhibitionEdit
Trójfosforan cytydyny (CTP), produkt końcowy ATCase, działa jako regulator allosteryczny. Fosforan karbamoilu i asparaginian kondensują do N-karbamoilasparaginianu pośredniego, który następnie tworzy CTP. CTP wiąże się do łańcucha r podjednostki regulatorowej nie stykając się z łańcuchami c. Wiązanie CTP stabilizuje stan T i obniża powinowactwo do substratu. Mimo, że miejsce wi±zania na podjednostce regulatorowej jest oddalone od podjednostki katalitycznej, to w wyniku wi±zania powstaj± czwartorzędowe zmiany strukturalne, które sprzyjaj± stabilizacji stanu T i inhibicji. Powoduje to przesunięcie krzywej sigmoidalnej w prawo. Reakcja będzie zachodzić szybko przy niskim stężeniu , ale przy wyższych stężeniach CTP będzie działać jako inhibitor ATCase przez miejsca regulatorowe lub allosteryczne, a nie aktywne. Jest to przykład ujemnego sprzężenia zwrotnego, w którym efekt końcowy przerywa reakcję wyjściową. Sprzężenie zwrotne hamujące CTP na ATCase może być odwrócone przez ATP.
Efekty heterotropowe — wpływ cząsteczek nie będących substratami na enzym
KooperatywnośćEdit
Szybkość tworzenia produktu N-karbamoilasparaginianu wzrasta wraz ze wzrostem stężenia Asparaginianu. Ponieważ ma on charakter kooperatywny, można zauważyć, że jego krzywa ma cechę sigmodalną, co oznacza, że wiązanie substratu w jednym miejscu cząsteczki zwiększa powinowactwo innych substratów do wiązania w innych miejscach cząsteczki. Krzywa sigmodalna ATCase zawiera w sobie mieszaninę dwóch krzywych Michaelisa-Mentena – jednej o wysokiej wartości KM (przedstawionej poprzez stan T), drugiej o niskiej wartości KM (przedstawionej poprzez stan R). Wiązanie substratu do podjednostki i w konsekwencji zmiana wszystkich pozostałych podjednostek nazywamy kooperatywnością. W kooperatywności, wiązanie w jednym miejscu zwiększa lub zmniejsza wiązanie w innym miejscu enzymu. Dzieje się tak dzięki zmianom konformacyjnym reszt sąsiednich podjednostek, które wpływają na zmianę kształtu innej podjednostki katalitycznej. Proces ten jest analogiczny do tego, jak hemoglobina kooperatywnie wiąże cząsteczki tlenu.
MechanismEdit
Ezym posiada dwa miejsca aktywne. Jedno z nich jest dla substratu, a drugie dla aktywatora allosterycznego, który znajduje się w miejscu regulacyjnym. Miejsce aktywne enzymu nie może związać substratu, gdy aktywatory allosteryczne nie są związane z miejscem regulatorowym. Z drugiej strony, jeśli aktywator allosteryczny zwiąże się z enzymem, kształt miejsca aktywnego, umożliwia wiązanie substratu, pozwalając na wytwarzanie produktów. Enzym pozostanie aktywny do momentu opuszczenia go przez aktywator allosteryczny.